AKT/mTOR信號通路調控miR-623表達對膀胱尿路上皮癌細胞侵襲和遷移的影響

王官峰 馬鋒 陳如

膀胱癌是常見的泌尿道惡性腫瘤，是發達國家第五種最常見的惡性腫瘤[1]。膀胱癌的病因較為復雜，涉及遺傳和環境因素。當腫瘤進展為侵襲性是復發率高且臨床預后差,膀胱癌的早期診斷和治療對于提高預后非常重要[2]。迄今為止許多研究報道了預測膀胱癌風險和復發的分子標記物，但膀胱癌發生發展的確切機制尚未闡明[3]。蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)與細胞增殖、細胞周期進展以及細胞凋亡等多種細胞密切相關[4]。AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路是膀胱癌治療的重要靶點，mTOR特異性抑制劑，雷帕霉素在膀胱癌中的作用以及膀胱癌中期下游分子通路的改變被廣泛研究[5]。微小核糖核酸-623(microribonucleic acid-623，miR-623)是一種新發現的miRNA，有報道miR-623在胃癌、胰腺癌和肺癌中發揮抑制癌因子的作用，能夠抑制細胞生長和腫瘤進展,然而miR-623在膀胱癌中的作用尚不清楚[6]。本文旨在研究基于AKT/mTOR信號通路研究調控miR-623表達對膀胱尿路上皮癌細胞侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞 膀胱尿路上皮癌細胞株T24細胞由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養膀胱癌細胞T24，并置于37℃、5%CO2恒溫培養箱。

1.2.2 細胞轉染及分組：采用LipofectamineTM200脂質體法將miR-623上調、miR-623下調轉染至人膀胱T24細胞，及miR-623上調、miR-623下調，以僅加入LipofectamineTM200而未轉染miR-623為膀胱癌組。等量接種T24細胞于6孔板中過液培養T24細胞貼壁生長至80%～90%融合度，miR-623上調組和miR-623下調組用終濃度為50 nmol/L的miR-623上調、miR-623下調轉染的完全培養基培養約24 h左右。

1.2.3 HE染色:采集3組細胞標本液置于試管內，低溫、3 000 r/min(半徑∶12 cm)離心10 min，分離上清液，-80℃超低溫冰箱內保存待檢。然后將3組細胞標本提取液置于4%多聚甲醛中浸泡固定，24 h后脫水處理，石蠟包埋，切成4 μm切片，依次經二甲苯、梯度乙醇水化后，蘇木精浸染5 min，鹽酸乙醇分色，自來水沖洗，1%伊紅染色2～3 min，脫水、透明、封片，光鏡進行觀察。

1.2.4 miR-623的表達檢測:采用實時熒光定量PCR檢測miR-623的表達：將采集到的100 μl細胞標本加300 μl Trizol震蕩混勻靜置10 min，加80 μl氯仿再次震蕩混勻靜置5 min，離心后凝膠靈心至管底，加100 μl DEPC水。將標本混合液1 500 μl，離心處理15 min。提取上清液轉移到含糖原EP管中，加等體積預冷異丙醇，混勻，-20℃靜置2 h。提取白色沉淀加1 ml 75%乙醇，混勻后充分洗滌RNA沉淀，4℃ 7 500 g，離心處理5 min，摒棄上清液。加80 μl DEPC水對RNA沉淀進行溶解，-80℃保存。采用逆轉錄試劑盒(TaqMan?miRNA Reverse Transcription Kit)逆轉cDNA。采用THUNDERBIRD qPCR Mix PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測，采用2-ΔΔCT法對miR-623表達水平分析。

1.2.5 細胞遷移能力檢測：取對數生長期的T24細胞，收集轉染后3組細胞并將其鋪種在6孔板上，待細胞生長至70%左右，用200 μl槍頭垂直與孔板和線制造細胞劃痕，盡量保證劃痕寬度一致，PBS洗滌3次以去除漂浮的細胞，再加入無血清培養基。于劃痕后24 h、48 h、72 h拍照。使用Image Pro Plus軟件進行分析，測量細胞遷移的距離。

1.2.6 細胞侵襲能力檢測：將Ma-trigel膠與RPMI-1640培養以1∶4體積比混合鋪于Transwell侵襲小室，于上室加經過不同接種的200 μl細胞懸液，下室加700 μl含30%的胎牛血清培養基，置于恒溫培養箱內繼續培養12～24 h。用脫脂棉小心拭去基質膠及上室內細胞；以多聚甲醛固定10 min，1%結晶紫染色5 min，PBS洗滌3～5次，晾干，倒置顯微鏡下統計侵入下室的細胞數目。

1.2.7 AKT、mTOR基因相對表達檢測:采用實時熒光定量PCR檢測(杭州晶格科學儀器有限公司)AKT、mTOR，檢測步驟同1.2.3。

1.2.8 細胞相關蛋白表達檢測:采用免疫印跡(Western blot)將采集到的細胞標本提取液，通過 1 000 r/min離心處理后提取沉淀，滴加裂解液、反復凍融后，120 000 r/min離心處理，提取上清液，采用酶標儀檢測p-AKT、p-mTOR蛋白濃度，保存。滴加10%的分離膠，封閉，吸干水分，給予5%的濃縮膠灌注，凝固后，將其在電泳槽中固定，加5 μl Marker、變性蛋白樣品，電泳干預30 min，待蛋白分離膠底，結束電泳；轉膜成功后將硝酸纖維素膜(Nitrocellulosefilter membrane，NC)膜在5%的脫脂奶粉中封閉固定1 h，加一抗(p-AKT、p-mTOR 1∶1 000)孵育，經過震蕩洗膜后加二抗(p-AKT、p-mTOR 1∶10 000)，孵育，再次震蕩洗膜，使用紅外熒光成像系統對結果給予分析。以GAPDH為內參。

2 結果

2.1 3組miR-623的表達 miR-623上調組表達低于膀胱癌組、miR-623下調組；miR-623下調組表達低于膀胱癌組，高于miR-623上調組(P<0.05)。見表1。

表1 3組miR-623的表達

2.2 3組細胞72h遷移結果比較 膀胱癌組的細胞遷移距離為(18.22±0.89)mm，而miR-623上調組為(27.17±0.92)mm，miR-623下調組為(19.77±0.40)mm。miR-623上調組細胞遷移距離高于膀胱癌組、miR-623下調組細胞遷移距離，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

膀胱癌組miR-623下調組miR-623上調組

2.3 3組細胞72 h侵襲結果比較 膀胱癌組細胞侵襲數(118.02±4.00)個，而miR-623上調組細胞侵襲數(70.30±2.36)個，miR-623下調組細胞侵襲數(105.00±3.51)個，miR-623上調組細胞侵襲數量低于膀胱癌組、miR-623上調組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

膀胱癌組miR-623下調組miR-623上調組

2.4 3組AKT、mTOR基因相對表達量 miR-623上調組AKT、mTOR表達低于膀胱癌組、miR-623下調組(P<0.05)；miR-623下調組AKT、mTOR表達高于miR-623上調組低于膀胱癌組(P<0.05)。見表2。

表2 3組AKT、mTOR基因相對表達量

2.5 3組蛋白相對表達量 miR-623上調組p-AKT、p-mTOR表達低于膀胱癌組、miR-623下調組(P<0.05)；miR-623下調組p-AKT、p-mTOR表達高于miR-623上調組，低于膀胱癌組(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 3組蛋白相對表達量

圖3 3組相關蛋白表達比較(Western blot)

3 討論

膀胱腫瘤是一個多步驟、多因素的漸進過程，受到系列基因的調控，引起眾多生物學過程的發生[7]。研究表明，miRNA的異常表達與腫瘤的發生、發展和侵襲和遷移密切相關，成為近年研究熱點[8]。有研究發現miR-623能夠抑制膀胱癌細胞遷移和侵襲，成為預防膀胱癌的新型輔助治療靶點[9]。

AKT/mTOR信號傳導通路在腫瘤發展中的作用主要抑制細胞凋亡、促進細胞生存、調節細胞周期，促進腫瘤新生血管的形成以及侵襲與遷移。而近年來研究發現此信號通路與膀胱癌的關系非常密切[10]。通過miR-623抑制AKT/mTOR信號通路的活性，調節細胞物質代謝與細胞侵襲和遷移，實現腫瘤抑制[11]。有研究發現mRNA表達率明顯低于表淺性癌，提示miR-623表達升高與膀胱癌的侵襲和遷移有關，miR-623可以通過調節AKT/mTOR信號通路，形象腫瘤細胞的侵襲轉移[12]。有研究發現膀胱癌中AKT和mTOR蛋白的相互作用促進了腫瘤的發生，且p-AKT、p-mTOR的表達與膀胱癌的發生有密切關系，AKT的活化可以組織膀胱癌T24細胞的侵襲和遷移[13]。本研究結果證實miR-623參與膀胱癌發生的過程。

本研究顯示，miR-623下調組T24細胞遷移能力提高，細胞侵襲能力降低。提示膀胱癌miR-623水平升高，說明miR-623參與膀胱癌發生的過程。有研究發現，miR-623在膀胱癌的侵襲和遷移中發揮重要作用，且在腎癌、胃癌結腸癌和肺小細胞癌等多種惡性腫瘤中發揮促癌作用，參與腫瘤的侵襲和遷移[14]。另有研究發現，下調miR-623后膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力受到抑制[15]。上調miR-623膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力得到恢復，說明通過調節miR-623的表達可以影響膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力[16]。

AKT激活可抑制細胞侵襲和遷移促進腫瘤細胞生存，有報道AKT組成性的激活抑制T24介導的侵襲，在膀胱尿路上皮癌細胞株中，AKT過表達使細胞凋亡侵襲，AKT表達降低可抑制細胞的侵襲凋亡的作用[17]。mTOR于20世紀90年代早期在研究Rapamycin(大環內酯類亦被稱為sirolimus)的作用機制時發現mTOR信號通路組成及作用機制十分復雜[18]。AKT/mTOR信號傳導通路是2個關鍵激酶，在許多腫瘤中異常激活，并因此成為最常被選中的調控目標，但在膀胱癌中是否存在AKT蛋白激酶異常激活目前研究并不多[19]。有研究顯示，細胞侵襲和遷移及周期等生物功能通過細胞內各種信號通路調節，AKT/mTOR是重要的信號傳導通路之一，其異常激活與腫瘤的發生發展密切相關[20]。有學者研究顯示，AKT/mTOR信號通路在乳腺癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中AKT/mTOR通路活化能夠抵抗化療、放療引發的細胞凋亡、遷移[21]。相反選擇性抑制AKT、mTOR活性，降低AKT、mTOR水平，使細胞對化療、放療所導致的凋亡遷移的敏感性增加[22]。

綜上所述，miR-623在膀胱癌組織中顯著，上調其表達可抑制腫瘤細胞的侵襲、遷移，作用機制與AKT/mTOR信號通路相關。