不同ELISA 試劑盒評價口蹄疫O 型、A 型二價滅活苗免疫效果對比

孫秀濤，沈?qū)W文，段文學(xué)，江紅梅，馬 琛，普星星，周 卓，謝居昆，王 薇，楊 東，孟 莉，石露莎，高 蕓，段平波，何克燦，張榮華

（1.紅河州動物疫病預(yù)防控制中心，云南蒙自 661199；2.建水縣動物疫病預(yù)防控制中心，云南建水 654399；3.瀘西縣動物疫病預(yù)防控制中心，云南瀘西 652400；4.彌勒市動物疫病預(yù)防控制中心，云南彌勒 652399；5.紅河州動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南蒙自 661199）

口蹄疫（foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）感染偶蹄動物引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，一旦疫情發(fā)生將會造成巨大經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重社會影響。世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列為須報(bào)告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[1]。FMD 傳染源主要為潛伏期感染及臨床發(fā)病動物，易感動物可通過呼吸道、消化道、生殖道和傷口感染病毒。牛羊等反芻動物感染后，會在食道-咽喉部持續(xù)帶毒。

FMDV 有7 個血清型，分別為O、A、Asia 1、C、SAT 1、SAT 2 和SAT 3，不同血清型之間無交叉保護(hù)反應(yīng)[2]。FMD 屬于我國重大動物疫病強(qiáng)制免疫病種，疫苗免疫注射是最有效的防控措施。因此，對疫苗的免疫效果進(jìn)行科學(xué)評價尤為重要。免疫效果評價的技術(shù)手段主要是抗體檢測，但是不同的檢測方法、檢測試劑會導(dǎo)致抗體檢測結(jié)果的差異[3]。ELISA 方法具備簡便、敏感、穩(wěn)定、易操作等優(yōu)勢，是目前實(shí)驗(yàn)室檢測動物免疫血清抗體主要的技術(shù)手段。本試驗(yàn)選取了市面上3 個不同廠家生產(chǎn)的ELISA 試劑盒，同時檢測了3 個免疫不同口蹄疫O 型、A 型二價滅活苗羊場的抗體水平，以期為選取合適的抗體檢測試劑盒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 在3 個縣市各選取1 家養(yǎng)殖管理?xiàng)l件較好的規(guī)模羊場，每個場選取120～150 日齡健康羊30 只，按照正常飼養(yǎng)條件單獨(dú)圈養(yǎng)。

1.1.2 疫苗種類 選取3 種政府招標(biāo)采購的口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗，分別在3 家養(yǎng)殖羊場中各免疫1 種，免疫程序和免疫劑量按照說明書進(jìn)行。

1.1.3 樣品準(zhǔn)備 免疫前采集羊食道-咽部黏液（O-P 液）和血清樣品，首免后28 d 和二免后28 d 采集羊全血樣品。樣品經(jīng)3000 r/min 離心2～5 min 后取上清液，置于2 mL 離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 檢測試劑 FMDV 通用型熒光RT-PCR 試劑盒（批號040192003），購自青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心；非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA 檢測試劑盒（批號FMDV20200507），購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司；3 種待測ELISA 試劑盒：S1（批號為1FMDO20096 和1FMDA20036）、S2（批號為020092015 和020071906）、S3（批號為20200928133 和20200927134）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室檢測 根據(jù)FMDV 通用型熒光RT-PCR 試劑盒、非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA 檢測試劑盒和3 種不同廠家生產(chǎn)的ELISA 抗體檢測試劑盒說明書，分別對FMDV 病原、感染抗體及免疫抗體進(jìn)行檢測。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 25.0 軟件，通過單因素方差分析方法，比較不同ELISA 試劑盒檢測抗體合格率的差異，P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 FMDV 病原及感染抗體檢測

免疫前，分別采集試驗(yàn)羊的O-P 液樣品和血清樣品各90 份，運(yùn)用通用型熒光RT-PCR 試劑盒檢測FMDV 病原，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA 試劑盒檢測FMDV 感染抗體，結(jié)果兩者均為陰性。

2.2 不同羊場免疫抗體檢測

2.2.1 羊場一 結(jié)果（表1）顯示：首免后28 d，S1、S2兩種試劑盒檢測的O型抗體合格率分別為96.55% 和100%，而S3 的檢測合格率僅為55.17%；檢測的A 型抗體合格率為13.79%～72.41%。二免后28 d，3 種試劑盒檢測的O 型抗體合格率為96.55%～100%，A 型抗體合格率為58.62%～82.76%。29 份血清樣品用3 種試劑盒檢測O 型抗體均為陽性的血清28 份，均為陰性的血清1 份，符合率為100%（29/29）；檢測A型抗體均為陽性的血清16份，均為陰性的血清4份，不同結(jié)果的血清9 份，符合率為68.97%（20/29）。

表1 羊場一免疫抗體檢測結(jié)果

2.2.2 羊場二 結(jié)果（表2）顯示：首免后28 d，S2 試劑盒檢測O 型、A 型抗體合格率分別為79.31% 和75.86%，S1 和S3的檢測合格率為27.59%～62.07%；二免后28 d，S2 試劑盒檢測O 型、A 型抗體合格率分別提高到了89.66%和93.10%，S1 和S3 檢測O 型抗體合格率分別提高到了89.66%和82.76%，但檢測A 型抗體合格率分別為55.17%和51.72%。29 份血清樣品用3 種試劑盒檢測O 型抗體均為陽性的血清21 份，8 份血清結(jié)果不一致，符合率為72.41%（21/29）；檢測A 型抗體均為陽性的血清13 份，均為陰性的血清1 份，其他15 份血清的結(jié)果不同，符合率僅為48.28%（14/29）。

表2 羊場二免疫抗體檢測結(jié)果

2.2.3 羊場三 結(jié)果（表3）顯示：首免后28 d，除S1 試劑盒檢測的A 型抗體合格率為58.62%外，S2、S3 檢測O 型、A 型抗體合格率及S1 檢測O型抗體合格率均達(dá)到國家70%以上的要求；二免后28 d，S1 檢測A 型抗體合格率下降為55.17%，S2、S3 檢測O 型、A 型抗體合格率有所提高，達(dá)到了75.86%～100%。29 份血清樣品用3 種試劑盒檢測O 型抗體均為陽性的血清21 份，均為陰性的血清2 份，6 份血清結(jié)果不一致，符合率為79.31%（23/29）；檢測A 型抗體均為陽性的16 份，其他血清的結(jié)果不一致，符合率為55.17%（16/29）。

表3 羊場三免疫抗體檢測結(jié)果

2.3 不同F(xiàn)MD 血清型檢測結(jié)果

3 家規(guī)模羊場使用不同疫苗二次免疫后，3 種試劑盒檢測O 型抗體的合格率都較高，合格率為75.86%～100%，各試劑盒檢測O 型抗體合格率均值分別為82.18%、86.21%、74.71%，無顯著性差異（P＞0.05）。3 種試劑盒檢測A 型抗體合格率為51.72%～100%，各試劑盒檢測A 型抗體合格率均值分別為49.42%、85.06%、55.75%，其中S2與S1、S3 之間差異顯著（P＜0.05），S1 和S3之間差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果說明，3 種ELISA 試劑盒均適用口蹄疫O 型抗體檢測，S2 試劑盒與S1、S3 試劑盒相比，更適合A 型抗體檢測。

3 討論

FMD 是危害我國畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要動物疫病之一，主要感染豬、牛、羊等偶蹄類動物，動物一旦感染發(fā)病會對養(yǎng)殖場戶造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前，疫苗免疫是防控FMD 最有效的措施。動物機(jī)體通過體液免疫產(chǎn)生抗體獲得保護(hù)，因此檢測抗體合格率水平，不僅可以客觀反映疫苗免疫后動物個體、群體所處的保護(hù)狀態(tài)，也是對免疫效果的直接評估[4]。

本試驗(yàn)比較了市面上3 種常見的ELISA 試劑盒檢測口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗免疫抗體合格率的差異。從二免后的抗體檢測結(jié)果來看，3家試劑盒檢測O 型抗體合格率均達(dá)到了國家要求的70%以上，且三者符合率為72.41%～100%。而對于A 型血清型，除S2 試劑盒的檢測合格率介于82.76%～100%，S1 檢測場二和場三的免疫抗體合格率及S3 檢測場一和場二的免疫抗體合格率均低于70%，且三者符合率為48.28%～68.97%，差異顯著（P＜0.05），這可能與試劑盒中A 型抗原差異有一定的相關(guān)性，這也符合田間監(jiān)測情況。

綜上所述，不同ELISA 試劑盒評價口蹄疫免疫效果存在一定差異，其中檢測A 型抗體試劑盒差異顯著（P＜0.05）；3 種ELISA 試劑盒均可用于口蹄疫O 型抗體檢測，S2 試劑盒適合A 型抗體檢測。提示在評價口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗的免疫效果時，如果兩血清型之間抗體合格率差別比較大，需要考慮調(diào)整檢測合格率低的試劑盒，以達(dá)到科學(xué)評價的目的。