納米孔測序技術(shù)在動物疫病防控中的應(yīng)用

白永明，巴依爾塔，李曉艷，姜永玲，李瑞剛，趙雷增，杜晨光，姜蘭劍，郭 宇0，烏日罕7，

（1.巴彥淖爾市動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000；2.通遼市動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古通遼 028000；3.呼和浩特市動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010032；4.赤峰市動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古赤峰 024099；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧廳，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；6.內(nèi)蒙古璽騰科技發(fā)展有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；7.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014109；8.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；9.內(nèi)蒙古嶺鑫機電設(shè)備有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；10.內(nèi)蒙古自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；11.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010013）

1977 年，第一代基因測序技術(shù)問世，基因組學(xué)開創(chuàng)；2005—2010 年，第二代基因測序技術(shù)商用，開啟高通量時代；2010—2014 年，以單分子為特點的第三代基因測序技術(shù)登場。納米孔測序技術(shù)是牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）研發(fā)的第三代基因測序技術(shù)，其初始技術(shù)概念出現(xiàn)于 1989 年，是通過電泳對穿過納米級孔道的單鏈 DNA 進行測序[1]。2014年，ONT 推出了首個商用納米孔測序儀 MinION。2021 年12 月，國產(chǎn)納米孔測序儀齊碳科技QNome-3841 量產(chǎn)。近年來，納米孔測序技術(shù)發(fā)展迅速，在傳染病防控、流行病學(xué)調(diào)查、臨床快速診斷、病原體基因組學(xué)研究等領(lǐng)域，憑借其便于攜帶、實時測序、超長讀長等技術(shù)優(yōu)勢，得到廣泛應(yīng)用[2-10]。本文簡要介紹了納米孔測序的原理與特點，闡述了其在國內(nèi)外獸醫(yī)實驗室的應(yīng)用現(xiàn)況和前景，以期為動物疫病防控提供新的技術(shù)支撐。

1 原理與特點

1.1 原理

所謂“納米孔”，是指納米級蛋白質(zhì)孔。它作為生物傳感器，嵌入到由一組流體芯片微支架支撐的電阻聚合物膜中（圖1）。在這張膜上施加恒定電壓產(chǎn)生電位差，由控速蛋白驅(qū)動單鏈 DNA 或RNA 分子，使其從帶負電的“順式”側(cè)到帶正電的“反式”側(cè)，以一定速度通過納米孔蛋白。不同的堿基會引發(fā)不同的電流變化，信號處理電路實時檢測記錄電流變化，并運用測序軟件對電信號進行解碼，這樣就實現(xiàn)了對單分子核苷酸序列的實時測序[11-12]。

圖1 納米孔測序原理

1.2 特點

1.2.1 操作簡單、便攜 和第二代基因測序技術(shù)相比，納米孔測序技術(shù)無需擴增，操作流程簡化，儀器和耗材便于攜帶，如MinION、QNome-3841測序儀只有U 盤大小，與筆記本電腦通過USB 口連接即可實時測序（圖2）。納米孔現(xiàn)場測序試劑盒無需冷鏈保存或運輸，文庫制備速度快，適合現(xiàn)場診斷動物疫病。

圖2 MinION 和QNome-3841 實物

1.2.2 快速實時測序 MinION 的流動池有2 048個納米孔，每個納米孔的DNA 測序速度約為450 bp/s；QNome-3841 有384 個納米孔，DNA 測序速度為350～450 bp/s。測序開始后，原始信號立刻傳輸?shù)接嬎銠C，產(chǎn)生FASTQ 格式數(shù)據(jù)并與數(shù)據(jù)庫分析比對，1 min 內(nèi)實時形成結(jié)果。野外環(huán)境下無需聯(lián)網(wǎng)即可測序，特別適用于基礎(chǔ)設(shè)施不完備的邊遠邊境地區(qū)。

1.2.3 超長讀長 MinION 的最大讀取長度為2.273 Mbp 堿基，平均讀取長度約為23 kbp，QNome-3841 的讀取長度為200 bp～1 Mbp，從而解決了第二代測序技術(shù)難以鑒別串聯(lián)重復(fù)序列等復(fù)雜DNA 結(jié)構(gòu)的弊端。這意味著基層獸醫(yī)實驗室僅憑納米孔測序平臺，即可獲得高質(zhì)量全基因組。

1.2.4 準(zhǔn)確度高 MinION（R9.4 芯片）和QNome-3841的單堿基序列測序準(zhǔn)確度分別為85%～94%和90%。這個準(zhǔn)確度固然無法精準(zhǔn)表征某個特定堿基的變異，但對獸醫(yī)實驗室來說，足以準(zhǔn)確鑒定病原體。

2 在動物疫病防控中的應(yīng)用

作為具有較高應(yīng)用價值的先進技術(shù)，隨著商品化進程加快，納米孔測序技術(shù)可能成為今后獸醫(yī)實驗室的有力手段。

2.1 現(xiàn)場處置新發(fā)、突發(fā)、外來動物疫情

進入自媒體時代后，突發(fā)動物疫情或畜禽不明原因死亡等公共衛(wèi)生事件，往往快速引發(fā)輿情和社會關(guān)注，給相關(guān)部門帶來很大壓力。獸醫(yī)實驗室現(xiàn)有的病原分離鑒定、抗原抗體反應(yīng)、PCR 核酸檢測等方法，只能針對已知病原體。面對突發(fā)、新發(fā)、外來動物疫情，或者轄區(qū)內(nèi)出現(xiàn)不明原因死亡畜禽時，獸醫(yī)實驗室通常立足現(xiàn)有檢測技術(shù)手段，采用“窮舉法”，把所能用到的檢測方法都嘗試一遍。這很難及時準(zhǔn)確鑒別病原體，給出精準(zhǔn)檢測結(jié)果。而基于宏基因組分析的納米孔測序技術(shù)，可彌補對未知病原體診斷能力的缺失，將納米孔測序與傳統(tǒng)檢測技術(shù)相結(jié)合，有助于提高基層有效應(yīng)對突發(fā)、新發(fā)、外來動物疫情以及處置公共衛(wèi)生事件的能力。

2019 年2 月，內(nèi)蒙古阿爾山市桑都爾林場210 頭野豬不明原因死亡。軍事獸醫(yī)研究所閆曉敏等[13]對脾臟樣品進行納米孔測序，10 min 內(nèi)構(gòu)建文庫，測序 4 min 即獲得首批1.25 kb 的序列讀數(shù)（reads），有效覆蓋非洲豬瘟病毒（ASFV）全基因組的特異性序列；在接到樣品后2 h 30 min 內(nèi)，共檢測出213 條序列，覆蓋28.1%的ASFV 全基因組，迅速確定本起疫情由ASFV 所致。同年，O'Donnell 等[14]利用“MinION+現(xiàn)場測序試劑盒（SQK-LRK001）”，模擬野外環(huán)境對ASF 全血樣本進行測序，核酸提取后15 min 即生成文庫，7 h 后，解析出 81% 的ASFV 全基因組，總耗時7 h 15 min；而實驗室條件下使用“MinION+快速文庫制備試劑盒（SQK-RPB004）”的對照組，核酸提取后2 h 15 min 生成文庫，3 h 30 min 內(nèi)即解析出100%完整的ASFV 全基因組，總耗時5 h 45 min。

2018 年，Hansen 等[15]開發(fā)了一種用于口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）血清分型的快速納米孔測序方法，在常規(guī)實驗室條件下，分別進行7 種FMDV 血清型的樣品制備和RNA 提取，然后使用MinION 直接進行cDNA 測序，在5 h 內(nèi)，完成了全部7 種FMDV 血清型樣品的基因測序及鑒定，總體映射特異性為98.3%。2021 年，Brown 等[16]進一步開發(fā)了一種MinION與RT-PCR 聯(lián)用，快速鑒別臨床樣品FMDV 血清型的方法；測序2 min 后，幾乎一半（4/9）的樣本100%覆蓋參考序列；測序10 min、30 min 和2 h 30 min 后，3 個細胞培養(yǎng)上清液、3 個舌上皮懸浮液和3 個口腔拭子樣本，全部100%覆蓋參考序列。

2.2 流行病學(xué)調(diào)查

全基因組測序是當(dāng)前分子流行病學(xué)調(diào)查的主流技術(shù)。2022 年，鄭晶等[17]對圓環(huán)病毒 3 型美國毒株，桑淼等[18]對禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒山東SD2101 株，田似報等[19]對豬流行性腹瀉病毒山東SD20BZ01 株，進行全基因組測序，這均為病毒遺傳變異和流行病學(xué)分析以及防控策略的科學(xué)制定，提供了重要參考和理論依據(jù)。

雖然第二代基因測序技術(shù)具備高通量、準(zhǔn)確度高、技術(shù)路線成熟等優(yōu)勢，但限于實驗環(huán)境條件，很難用于現(xiàn)場動物疫病診斷，且時效性差。基于擴增子或不依賴序列的單一引物核酸擴增技術(shù)（sequence-independent single primer amplification，SISPA）的納米孔測序技術(shù)，將納米孔測序儀與PCR 聯(lián)合應(yīng)用，以快速獲得病原體全基因組序列，進而展開分子流行病學(xué)調(diào)查，這對疫病防控意義重大。

2021 年，Park 等[20]使用qPCR 與MinION，對攜帶漢坦病毒（Hantaan virus，HTNV）的黑線姬鼠肺組織樣品，進行基于擴增子的納米孔測序，8 h 后，得到同源性為99.8%（L和M片段）和99.7%（S 片段）的HTNV 全基因組序列。同年，Kinimi 等[21]使用基于擴增子的納米孔測序技術(shù)，分別對2016 年和2018 年從坦桑尼亞山羊中收集的小反芻獸疫病毒（PPRV）陽性樣本進行測序，4 h內(nèi)生成了2 個完整的PPRV 全基因組。2021 年2 月，Crossley 等[22]將PCR 與MinION 組合作為快速實驗室檢測工具，通過基于擴增子的納米孔測序技術(shù)，使用臨床樣本，對禽流感病毒（AIV）所有8 個基因片段進行測序，從拭子送達實驗室到獲得完整的全基因組，最快15 h。

2.3 動物疫病監(jiān)測

對跨邊境野生動物和遷徙野禽攜帶的病原體，特別是未知病原體的檢測，目前欠缺合適的技術(shù)手段[23-25]。內(nèi)蒙古有4 200 km 邊境線，有呼倫湖、烏梁素海和黃河流域濕地等遷徙野禽棲息地，棲息著大量黃羊、狼、狐貍、草原蜱以及野禽等跨邊境野生動物，如何對其有效開展病原體檢測，是迫切而現(xiàn)實的問題[26-27]。在“邊境地區(qū)動物疫病聯(lián)防聯(lián)控”機制下，以納米孔測序為抓手，探索建立靈敏可靠、靈活機動、快速反應(yīng)的外來病原體監(jiān)測預(yù)警網(wǎng)，是一個值得嘗試的課題[28]。

2020 年，Oude 等[29]采用多重納米孔宏基因組測序技術(shù)，確認卡塔爾 Alkharsah 地區(qū)被野生狐貍咬傷后死亡的駱駝以及被捕獲的狐貍所感染的狂犬病病毒（RABV）序列來自阿拉伯半島的一個進化支和集群。同年，McCuen 等[30]結(jié)合雷達遙感和切向流超濾技術(shù)，通過基于擴增子的多重納米孔測序，對加利福尼亞州兩個高水禽密度濕地的水樣、土壤和候鳥糞便樣品進行禽流感病毒（AIV）檢測，檢出來自26 個鳥類宿主的4 種AIV 亞型。2021 年，Sarchese 等[31]通過基于SISPA 的納米孔測序技術(shù)，從1 只死亡野狼的糞便樣本中，鑒定表征了1 株基因3 型戊型肝炎病毒（HEV-3）的全基因組。同年，Brinkmann 等[32]采用基于SISPA 的納米孔測序技術(shù)，表征了蜱標(biāo)本和培養(yǎng)蜱攜帶的克里米亞-剛果出血熱病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever Virus，CCHFV）宏基因組。

2.4 動物疫病臨床診斷

對畜禽群發(fā)性疫病的快速診斷，是動物疫病預(yù)警體系的重要組成部分。使用納米孔測序技術(shù)，2016 年Vanmechelen 等[33]在長頸鹿的疣中鑒定出一種新型乳頭瘤病毒，2017 年Günther 等[34]獲得了從灰海豹中分離出的副痘病毒全基因組，2019 年Wongsurawat 等[35]檢測出委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEEV）。在豬病臨床診斷領(lǐng)域，已有多種新病毒，如科布病毒（kobu viruses）、正呼腸孤病毒（orthoreovirus）、豬星狀病毒（porcine astrovirus，PAstV）、腸道病毒（enteroviruses）、環(huán)狀 DNA 病毒（circular DNA viruses）、沙波病毒（sapporo virus）、博卡病毒（bocavirus）、皮可比那病毒（picobirnaviruses）、豬捷申病毒（porcine teschovirus）[36-42]等，通過病毒宏基因組學(xué)得到準(zhǔn)確鑒定。

2018 年，Theuns 等[43]將細胞培養(yǎng)的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和輪狀病毒A（RVA）匯集后進行納米孔測序，測序7 s 和24 s 后，分別生成了匹配PEDV 和RVA 的第一個讀數(shù)；PEDV 測序1 h內(nèi)獲得高測序深度（43.0×），11 個RVA 基因片段在3 h 內(nèi)獲得高測序深度（19.2～48.2×）；對1周齡仔豬的腹瀉糞便樣本測序，使用BLASTn算法，在26 s 內(nèi)準(zhǔn)確鑒別出豬科布病毒（18～22 個讀數(shù)）、腸道病毒G（5～9 個讀數(shù)）和星狀病毒（4 個讀數(shù)）。同年2 月，Mccabe 等[44]將3 種新用于生產(chǎn)牛呼吸道疾病（BRD）改性活疫苗（MLV）的牛呼吸道病毒——合胞病毒（BRSV，RNA 病毒）、牛皰疹病毒1 型（BoHV1，DNA 病毒）和牛副流感病毒3 型（BPI-3，RNA 病毒）的胎兒肺細胞培養(yǎng)物合并，采用MinION 測序運行16 h，生成并分析了7 000 多個測序讀數(shù)，其中2 937 個讀數(shù)被確定為病毒（2 926 個被識別為 BRSV、BoHV1 和BPI-3）。

近年來，已有企業(yè)把納米孔測序技術(shù)成功用于獸醫(yī)臨床[45]。納米孔測序技術(shù)在保障畜牧業(yè)生產(chǎn)的同時，也為動物疫病預(yù)警開辟了一條新技術(shù)途徑。

2.5 病原體基因庫建立

完善農(nóng)業(yè)微生物等生物種質(zhì)資源基因庫，是《“十四五”全國農(nóng)業(yè)農(nóng)村科技發(fā)展規(guī)劃》提出的目標(biāo)[46]。動物疫病病原體是農(nóng)業(yè)微生物的一個重要門類，按照時間線和空間橫斷面，有計劃、有步驟地建立病原體基因庫，不但可為今后的分子流行病學(xué)調(diào)查打下牢固根基，還可以根據(jù)耐藥和毒力基因的變化，預(yù)判病原體的耐藥和預(yù)后情況，科學(xué)調(diào)整防控措施。

烏干達牛走廊（the Ugandan cattle corridor，UCC）是自烏干達Mbarara 延伸至其邊境的一片形似走廊的地理區(qū)域，養(yǎng)殖的牛只總數(shù)占全國的45%。2018 年，Pullen 等[47]利用納米孔測序技術(shù)開展人-動物界面的結(jié)核病橫斷面監(jiān)測，建立了UCC 牛型結(jié)核分枝桿菌（Mbv）基因庫；通過與醫(yī)療中心合作取得結(jié)核病人痰液樣本，與屠宰場合作取得肉牛血液和淋巴結(jié)樣本，利用基因水平的系統(tǒng)發(fā)育分析方法，明確了Mbv 在此區(qū)域的傳播規(guī)律；通過對Mbv 毒力和耐藥基因的跟蹤性比對分析，取得了具有臨床意義的耐藥性分析結(jié)論和用藥指導(dǎo)建議。

2021 年，Bolotin 等[48]使用MinION，對1974年從烏克蘭盧甘斯克地區(qū)羊流產(chǎn)胎兒中分離出的布魯氏菌菌株進行全基因組測序，運行48 h 后，得到兩條共3 281 317 bp 的環(huán)狀染色體，PATRIC完整性評分100%，基因組包含55 個tRNA、9 個rRNA 和3 329 個DNA 編碼序列，34 個抗生素抗性基因（耐藥因子）和228 個毒力因子，證明了納米孔測序平臺具有獨立建立布魯氏菌基因庫的能力。2022 年，Craddock 等[49]基于第二代測序Illumina 和納米孔測序MinION 混合平臺，對來自以色列南部的18 個布魯氏菌分離株進行測序并把數(shù)據(jù)混合組裝，得到了“最全面”的布魯氏菌基因庫數(shù)據(jù)。

3 不足與展望

作為分子生物學(xué)和 IT 技術(shù)高度融合的產(chǎn)物，納米孔測序技術(shù)在簡化操作流程的同時，也增強了對計算機分析軟件和硬件算力的依賴。2020 年，Harris 等[50]對納米孔測序技術(shù)在美國農(nóng)業(yè)部國家動物健康實驗室網(wǎng)絡(luò)（NAHLN）的應(yīng)用進行了總結(jié)，發(fā)現(xiàn)NAHLN 技術(shù)人員對基因測序分析軟件和計算機硬件的滿意率只有53%～63%。開發(fā)一系列易于操作、用戶友好、貼近實務(wù)的界面分析軟件，以彌補獸醫(yī)實驗室技術(shù)人員生物信息數(shù)據(jù)分析能力的普遍欠缺與不足，對納米孔測序技術(shù)在動物疫病防控中的大規(guī)模應(yīng)用具有決定性作用。

21 世紀(jì)以來，PCR 核酸檢測技術(shù)已經(jīng)在我國各級獸醫(yī)實驗室逐步落地并成為主流。從技術(shù)特點分析比較，納米孔測序技術(shù)在宏基因組分析和全基因組研究方面，具有PCR 無可比擬的技術(shù)優(yōu)勢。將納米孔測序技術(shù)穩(wěn)步納入獸醫(yī)實驗室能力建設(shè)體系，可在檢測靈敏度、準(zhǔn)確度、分辨率，以及穩(wěn)定性、可靠性、時效性等多個維度，有效提升各級獸醫(yī)實驗室的技術(shù)支撐能力，有助于更好地服務(wù)于動物疫病防控大局。2017 年，我國疾病預(yù)防控制系統(tǒng)建立了國家致病菌識別網(wǎng)。時至今日，基因測序已經(jīng)成為疾病控制系統(tǒng)（國家、省、市、縣四級）實驗室傳染病監(jiān)測和分子流行病學(xué)調(diào)查的常規(guī)工具[51-52]。

隨著納米孔測序技術(shù)的不斷發(fā)展，其測序通量、準(zhǔn)確度和自動化程度有望進一步提高，測序成本和時間周期有望進一步下降，生物信息數(shù)據(jù)分析軟件的豐富性和易用性有望進一步改善。展望未來，納米孔測序技術(shù)在動物疫病防控中的應(yīng)用潛力巨大，將在實踐中得到更好地發(fā)揮與證明。