實(shí)際生產(chǎn)中化制法無害化處理病死豬的病毒殺滅效果

劉梅芬，馬震原，閆若潛，趙雪麗，謝彩華，王 翠，柴 茂，趙美雪，宋 丹，王東方，劉 影，靳 冬，王淑娟

（河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南省重大動(dòng)物疫病監(jiān)測預(yù)警及防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450008）

我國每年因動(dòng)物疫病導(dǎo)致禽畜死亡的數(shù)量巨大，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失每年超過200 億元[1]。若病死動(dòng)物未經(jīng)無害化處理而流入市場或污染環(huán)境，將直接威脅養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和人類身體健康[2]。對(duì)病死及病害動(dòng)物及其相關(guān)動(dòng)物產(chǎn)品進(jìn)行無害化處理是避免病原擴(kuò)散及傳播的有效途徑。

無害化處理是用物理、化學(xué)等方法處理病死、病害動(dòng)物及其相關(guān)動(dòng)物產(chǎn)品，消滅其所攜帶的病原體，消除危害的過程[3]。無害化處理方法有焚燒法、化制法、深埋法、高溫法和硫酸分解法等。焚燒法雖能通過氧化反應(yīng)或熱解反應(yīng)殺死病原，但存在空氣污染隱患；深埋法如果填埋不當(dāng)，容易造成水源及土壤污染，且操作成本高，還存在病原溢出及掩埋的病死動(dòng)物尸體被動(dòng)物扒出撕咬或人為挖出流入市場的風(fēng)險(xiǎn)[4]；硫酸分解法存在過量硫酸污染水源和土壤的風(fēng)險(xiǎn)；高溫法處理時(shí)間較長、成本高，且存在受熱不均、病原體殺滅不徹底的風(fēng)險(xiǎn)。上述方法都存在二次污染環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)和生物安全風(fēng)險(xiǎn)[5]。化制法是指在密閉的高壓容器內(nèi)，向容器夾層或容器內(nèi)通入高溫飽和蒸汽，在干熱、壓力或蒸汽、壓力的作用下，處理病死、病害動(dòng)物和相關(guān)動(dòng)物產(chǎn)品的方法。化制法和高溫法均指在封閉容器內(nèi)高溫處理，高溫法為常壓條件下殺滅病原微生物，而化制法為高溫高壓法，具有殺滅效果好、處理效率高、處理能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，處理效果優(yōu)于高溫法。化制法是目前國內(nèi)無害化處理廠使用最為廣泛的無害化處理工藝[6]。

本研究自3 個(gè)應(yīng)用化制法工藝處理病死豬尸體的規(guī)模化豬場，采集無害化處理前及經(jīng)化制法無害化處理后的病死豬尸體樣品，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）方法，檢測每份樣品中的常見豬病病原核酸，包括非洲豬瘟病毒（ASFV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）、豬偽狂犬病毒（PRV）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）與豬流行性腹瀉病毒（PEDV）等。將病原核酸檢測陽性的樣品分別在BHK21、Vero、PK15 和Marc145 等4 種細(xì)胞上進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)并盲傳3 代，利用相應(yīng)PCR 方法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行上述病原的核酸檢測，通過病毒分離培養(yǎng)物中病原核酸檢出情況，評(píng)估該工藝在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中無害化處理病死豬尸體的病毒殺滅效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 選取3 個(gè)應(yīng)用化制法工藝處理病死豬尸體的規(guī)模化豬場（編號(hào)A、B、C），其中A、C 場采用干化法，B 場采用濕化法。病死豬尸體處理之前，在每個(gè)豬場各采集3 個(gè)批次的包含淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、腎臟、肺臟、小腸、胎衣等的混合樣品各1 份（分別編號(hào)A1～3、B1～3、C1～3），無害化處理后采集對(duì)應(yīng)批次的固體樣品。無害化處理前后各采集樣品9 份。

1.1.2 主要試劑 磁珠法核酸提取試劑盒，購自西安天隆科技有限公司；ASFV（GB/T 18648—2020）、CSFV（GB/T 16551—2020）、PCV2（GB/T 35901—2018）、PRV（GB/T 35911—2018）、FMDV（GB/T 18935—2018）、PRRSV（GB/T 35912—2018）等病原的FQ-PCR 檢測方法所用引物探針，均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，并依據(jù)各自的國家標(biāo)準(zhǔn)自行配制；TGEV、PEDV、PPV 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒，購自洛陽萊普生生物科技有限公司；以上病原的陽性對(duì)照質(zhì)粒，由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室提供；DMEM 培養(yǎng)基，購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清，購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix、ExTaqDNA 聚合酶、dNTPs、酶抑制劑等，均購自寶生物工程（大連）有限公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶等，購自Promega 公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 二級(jí)生物安全柜，美國Baker 公司產(chǎn)品；全自動(dòng)核酸提取儀，西安天隆科技有限公司產(chǎn)品；熒光PCR 儀，美國ABI 公司產(chǎn)品；臺(tái)式離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱，美國Thermos 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 處理前后樣品病原核酸檢測 利用上述檢測方法和試劑盒檢測無害化處理前后樣品中的ASFV、CSFV、PCV2、PRV、FMDV、PPV、PRRSV、TGEV 和PEDV 等病原核酸。

1.2.2 陽性樣品病毒分離培養(yǎng) 將1.2.1 中病原核酸檢測陽性的樣品，按照常規(guī)病毒分離方法[7]，分別在BHK21、Vero、PK15 和Marc145 等4 種細(xì)胞上進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)并盲傳3 代。

1.2.3 病毒分離培養(yǎng)物病原核酸檢測 對(duì)每一代病毒分離培養(yǎng)物進(jìn)行ASFV、CSFV、PCV2、PRV、FMDV、PPV、PRRSV、TGEV 和PEDV 等病原核酸檢測。

2 結(jié)果

2.1 處理前后樣品病原核酸檢測

化制法無害化處理前，A1 和A3 檢出PCV2和PRV 核酸陽性，A2 檢出PCV2 核酸陽性，B1、B2、B3 均檢出PCV2 和PEDV 核酸陽性，C1、C2 均檢出PRV 核酸陽性。化制法無害化處理后，A1 檢出PCV2 和PRV 核酸陽性，A2 和A3 檢出PCV2 核酸陽性，B3 檢出PCV2 核酸陽性，其余均為核酸陰性。

2.2 陽性樣品病毒分離培養(yǎng)

根據(jù)2.1 的結(jié)果，將處理前后的A1、A2、A3、B3 樣品和處理前的B1、B2、C1、C2 共12份樣品分別在BHK21、Vero、PK15 和Marc145 等4 種細(xì)胞上進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)并盲傳3 代。結(jié)果顯示，只有處理前的A1、A3、B1、C1 和C2 共5 份樣品可以引起細(xì)胞病變，其中處理前A1、A3、C1和C2 引起PK15 細(xì)胞病變，B1 引起Vero 細(xì)胞病變（圖1、2）。

圖1 樣品在PK15 細(xì)胞上的培養(yǎng)結(jié)果

圖2 樣品在Vero 細(xì)胞上的培養(yǎng)結(jié)果

2.3 病毒分離培養(yǎng)物病原核酸檢測

將12 份樣品在各細(xì)胞上的每一代病毒分離培養(yǎng)物進(jìn)行病原檢測。結(jié)果（表1）顯示：15 份處理前樣品培養(yǎng)物中檢出病原核酸陽性，其中A1、A3、C1 等3 份樣品的1～3 代培養(yǎng)物均檢出核酸陽性，說明存在活病毒；而經(jīng)化制法無害化處理后樣品的培養(yǎng)物均未檢出核酸陽性，說明未有活病毒。

表1 培養(yǎng)物中病原核酸檢測結(jié)果

3 討論

病死動(dòng)物存在大量的病原微生物，是多種動(dòng)物疫病發(fā)生與傳播的重要傳染源之一[8]。科學(xué)有效處理病死動(dòng)物，可阻止病原微生物在環(huán)境中的生存、傳播和擴(kuò)散，避免對(duì)環(huán)境的污染和對(duì)人的危害，從而維護(hù)生態(tài)環(huán)境安全和公共衛(wèi)生安全，對(duì)維護(hù)國家公共衛(wèi)生和生物安全具有重要意義。

化制法分為干化法和濕化法。干化法主要是將病死畜禽尸體進(jìn)行破碎后送入高溫高壓的容器中，溫度高于140 ℃，壓力大于0.5 MPa，處理時(shí)間大于4 h，經(jīng)加熱烘干后產(chǎn)生的熱蒸汽經(jīng)廢氣處理系統(tǒng)排出，尸體殘?jiān)?jīng)壓榨系統(tǒng)進(jìn)行處理；濕化法則需要利用蒸汽進(jìn)行高溫、高壓處理后對(duì)處理物進(jìn)行初次固液分離，固體物經(jīng)破碎后送入烘干系統(tǒng)，液體則送入油水分離系統(tǒng)進(jìn)行處理[9]。化制法是現(xiàn)行《病死及病害動(dòng)物無害化處理技術(shù)規(guī)范》中明確的病死及病害動(dòng)物和相關(guān)動(dòng)物產(chǎn)品的處理方法之一，也是目前國內(nèi)無害化處理廠使用最為廣泛的無害化處理工藝，但其在實(shí)際生產(chǎn)環(huán)節(jié)的落實(shí)情況未見公開報(bào)道，本研究就是針對(duì)這一問題開展的。本研究所采集的樣品既有干化法也有濕化法處理前后的病死豬尸體樣品。A 場和C 場采用的是干化法無害化處理，工作條件為140 ℃、0.5 MPa，工作時(shí)間5 h；B 場采用的是濕化法無害化處理，工作條件為135 ℃、0.3 MPa，工作時(shí)間5 h。

本研究之所以選擇BHK21、Vero、PK15 和Marc145 這4 種細(xì)胞，是因?yàn)檫@4 種細(xì)胞可以增殖出涵蓋ASFV、CSFV、PCV2、PRV、FMDV、PPV、PRRSV、TGEV 和PEDV 等的常見豬病病原。PRV、FMDV 可在BHK21 細(xì)胞上增殖[10-11]，CSFV、PCV2、PPV、TGEV 可在PK15 細(xì)胞上增殖[12]，PEDV 可在Vero 細(xì)胞上增殖[13]，PRRSV可在Marc145 細(xì)胞上增殖[14]。在無害化處理前后樣品的病原核酸檢測結(jié)果中，出現(xiàn)處理前樣品為病原核酸檢測陽性而處理后核酸檢測陰性的情況，是因?yàn)樵诨品ㄌ幚砬埃瑯悠分写嬖诖罅烤哂猩飳W(xué)活性且能在細(xì)胞中傳代的病原，而無害化處理過程中病原被殺死且其核酸被破壞，所以處理后樣品為病原核酸檢測陰性。培養(yǎng)物病原核酸檢測結(jié)果中，一些樣品出現(xiàn)第1 代培養(yǎng)物為核酸檢測陽性，而第2 代和第3 代培養(yǎng)物為核酸檢測陰性，是因?yàn)闃悠分写嬖诘牟≡怂釟埩粼诘? 代培養(yǎng)物中，但其病原已經(jīng)被殺死，不能在細(xì)胞上穩(wěn)定增殖，而第2 代和第3 代培養(yǎng)物中的病原核酸被大量稀釋，致使檢測結(jié)果為陰性。

本研究利用FQ-PCR 方法，對(duì)化制法處理前后的樣品進(jìn)行常見豬病病原核酸檢測，將篩選出的病原核酸檢測陽性樣品進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)并盲傳3代后，再對(duì)增殖的每一代培養(yǎng)物進(jìn)行病原核酸檢測，結(jié)果顯示化制法處理前病死豬尸體樣品中存在活病毒可增殖傳代，而化制處理后樣品的細(xì)胞培養(yǎng)物中均未發(fā)現(xiàn)活病毒，說明化制法在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中能有效殺死病死豬尸體樣品中的活病毒，達(dá)到了無害化處理目標(biāo)。

本研究只進(jìn)行了常見病毒的無害化處理效果對(duì)比，但選取的病毒，既有DNA 病毒也有RNA病毒，因此研究結(jié)果具有一定代表性。本研究未對(duì)細(xì)菌殺滅效果進(jìn)行試驗(yàn)，是因?yàn)樵跇悠凡杉^程中，樣品會(huì)受很多雜菌影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)中尚難以排除。