新疆和靜縣焉耆馬體表硬蜱種屬鑒定及進化分析

諾明達來，甘 露，才思蓋來，鄭會珍，劉 燕，吐熱古麗，呼爾查，3，巴音查汗

（1.新疆農業大學動物醫學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.和靜縣巴倫臺鎮烏拉斯臺村，新疆和靜 831412；3.新疆農業大學獸醫學博士后流動站，新疆烏魯木齊 830052）

焉耆馬是新疆地區優良馬品種之一，是眾多馬品種中的佼佼者。焉耆馬主要分布在新疆的博湖縣、和靜縣、和碩縣和焉耆縣等地，其中在和靜縣數量最多[1]。焉耆馬善于爬山、涉水，耐高寒、高熱，抗病性強，能夠在各種草場覓食，具有持久耐勞的特性，素有海馬龍駒之稱。

蜱是動物體表吸血的節肢動物，其傳播病原的危害僅次蚊類，是多種動物和人類疾病的貯藏宿主和傳播媒介。蜱隸屬節肢動物門蛛形綱蜱螨亞綱寄螨總目蜱目。目前世界上的蜱類有3 科18 屬899 種，其中在我國有2 科10 屬119 種，而在新疆就有2 科9 屬45 種[2]。革蜱屬（Dermacentor）全世界已記錄的有30 余個種和亞種，其中以古北界種類最多，我國記錄的有13 種，僅新疆地區就有8 種[3]。據相關資料[4]記載，全世界約有10%的蜱攜帶病原體，攜帶的病原體包括83 種病毒、32 種原蟲、20 種立克次體、18 種螺旋體、14 種細菌、2 種線蟲、1 種支原體和1 種巴爾通氏體。蜱在動物體表寄生時，以叮咬方式吸血。蜱將螯肢和口下板一同刺入宿主皮膚，造成宿主皮膚充血、水腫，使其不安、疼痛，且引起過敏性皮炎和傷口蛆病等[5]。當動物體表有大量蜱寄生時，由于蜱可分泌毒素和吸取大量血液，引起患畜麻痹、貧血和消瘦等，使毛、皮、奶和肉類產品質量嚴重下降，給畜牧業帶來了嚴重危害[6]。

本研究從和靜縣及周邊地區，隨機采集焉耆馬體表及其飼養環境中的硬蜱，運用傳統形態學和分子生物學相結合的方法進行蜱種鑒定，并通過生物信息學軟件，對采集蜱的COI基因序列進行分析，以期為后期開展地方性蜱種研究與蜱傳疾病防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1×磷酸緩沖液（PBS）、10%氫氧化鈉、瓊脂糖、溴化已錠、載玻片、蓋玻片，均購自北京鼎國生物技術有限責任公司；樹脂型TM 基因組DNA 提取試劑盒、蛋白酶K、2×EcoTaqPCR Super Mix，購自北京賽百盛基因技術有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒，購自康為世紀生物工程有限公司；MoticSMZ-16B 體視顯微鏡，購自麥克奧迪事業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 2022 年3—5 月，采集和靜縣自然放牧馬體表寄生和飼養環境中的蜱830 只，用70%酒精保存，并做好標記，帶回實驗室進行形態學和分子生物學鑒定。

1.2.2 玻片制作及形態學鑒定 將蜱蟲體按以下步驟制作標本[6]：投入沸水中1～2 min，待肢體伸直后將其放入已經加溫的10% NaOH 溶液中煮沸數分鐘（對較大的蟲體，須用昆蟲針在蟲體上刺些小孔，以利蟲體內部組織溶出），直至蟲體內部的肌肉和內臟被溶解排出；至蟲體軟化透明時，將其取出放入清水中洗去堿液，洗時輕輕壓擠蟲體，使內容物排凈（或把蟲體置吸水紙上輕輕壓擠，使內容物排出后被吸水紙吸附），再置清水中清洗；洗凈后的蟲體依次經過30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精以及體積比1:1 的無水酒精二甲苯和純二甲苯各浸泡0.5～1 h（較大蟲體時間取高限），然后用加拿大樹膠封片。參照《新疆蜱類志》[7]和《蜱類學》[8]的昆蟲分類標準，利用普通光學顯微鏡對采集到的蜱進行初步鑒定，利用數碼體視顯微鏡進一步對比其背面、腹面、假頭、假頭基、軀體、盾板、頸溝、側溝、肢節IV、氣門板等。

1.2.3 蜱樣處理及DNA 提取 從經初步形態學鑒定的蜱中隨機挑選3 只，用1×PBS 洗3 次，清洗干凈后蜱放入一次性采血器中，倒入液氮用研缽磨碎，加入200 μL 1×PBS 吹打混勻后加入到EP 管內，再加入200 μL GA 液和20 μL 蛋白酶K（proteinese K），放至水浴鍋內2～3 h，使其完全溶解，以提高蜱DNA 濃度；隨后，按照樹脂型基因組DNA 提取試劑盒說明書提取其DNA，-20 ℃保存。

1.2.4COI基因引物設計 參考文獻[9]設計COI基因引物序列（表1），對5 個采樣點的蜱DNA 進行COI基因PCR 擴增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應體系：2×EcoTaqPCR Super Mix 6.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 補足至13.0 μL。

表1 引物序列

1.2.5COI基因擴增及克隆 以提取的蜱DNA為模板，對COI基因進行PCR 擴增。PCR 擴增體系 為25.0 μL：TaqMix 12.5 μL、ddH2O 7.5 μL、上游引物2.0 μL、下游引 物2.0 μL、DNA 模板1.0 μL。COI基因 PCR 擴增條件：95 ℃預變性5 min；95℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環[10]。PCR 擴增結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳，按照Axy GEN DNA 凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段，膠回收產物與pMD19-T載體連接。連接體系為10 μL：pMD19-T 1 μL、PCR 產物4 μL、solution I 5 μL。冰浴30 min 后，加入感受態細胞50 μL，熱激42 ℃、45 s，冰浴2 min；加入無抗性液體培養基900 μL，搖菌培養1 h；出現絮狀物后，10 000 r/min 離心4 min，棄掉850 μL 上清，將剩余的150 μL 吹打混勻，然后加入到含氨芐青霉素的普通固體培養基上涂布均勻，放入37 ℃恒溫箱，前30 min 正面放置，后倒置過夜；待普通固體培養基上長出單菌落時進行菌液PCR 檢測，將出現陽性條帶的進行保菌，保存至-80 ℃，送上海生工生物科技有限公司測序。

1.3 同源性比較及系統進化樹構建

利用Meagalign 與Mega11.0 生物學軟件中的鄰接法（NJ）進行同源性比較及遺傳進化樹構建。分析模型為Tamura 3-parameter，進行1 000 次自主復制，以確定模型的穩定性，最終獲得系統發育進化樹。

2 結果

2.1 形態學鑒定

在采集的830 只蜱中，經形態學鑒定，鑒定出421 只邊緣革蜱、306 只草原革蜱、103 只森林革蜱，均屬于革蜱屬，具體見表2。

表2 焉耆馬體表及環境中采集到的蜱種及數量 單位：個

2.1.1 初步形態學鑒定 邊緣革蜱雄蜱背面（圖1-A）和腹面（圖1-D）：體呈卵圓形，前部漸窄，后部寬圓，假頭基呈卵圓形，寬稍大于長；側緣幾乎平行，后緣向內微彎；基突粗短，長小于基部之寬；須肢粗短，外緣呈弧形凸出，第2 節略長于第3 節，后緣有很短的背側，末端圓鈍。草原革蜱雄蜱背面（圖1-B）和腹面（圖1-E）：體呈卵圓形，假頭基呈矩形，寬略大于長，基突寬短；須肢寬短，外緣呈圓弧形，第2 節背后緣有細小的短刺。森林革蜱雄蜱背面（圖1-C）和腹面（圖1-F）：假頭基呈矩形，寬稍大于長，兩側幾乎平行；盾板呈卵圓形，盾窩之后的水平最寬，向前漸窄，向后寬圓；表面琺瑯彩較淡，前半部及中間較多，后半部較少。

圖1 雄蜱外部形態（20×）

2.1.2 細微形態學鑒定 在光學顯微鏡下，邊緣革蜱、草原革蜱、森林革蜱的假頭基形狀，軀體形狀，盾板表面琺瑯彩的分布頸溝和側溝，以及肢節IV、氣門板，都具有一定的區別，具體見表3。

表3 焉耆馬體表3 種革蜱光學顯微鏡下的主要鑒定特征

2.2 分子生物學鑒定

2.2.1COI基因PCR 擴增 PCR 擴增蜱線粒體COI基因片段，經12 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分析，發現在709 bp 處有目的條帶，條帶大小與預期片段大小一致（圖2）。

圖2 COI 基因PCR 擴增結果

2.2.2 同源性比較及遺傳進化樹構建 同源性比對結果（圖3）顯示；測序獲得的邊緣革蜱COI基因序列與選取的參考株同源性為99.2%～99.8%，其中與新疆株（HM193889、HM193890）同源性達99.8%；草原革蜱COI基因序列與選取的參考株同源性為99.8%～100%，其中與新疆株（KF583573）同源性為100%；森林革蜱COI基因序列與選取的參考株同源性為99.3%～99.6%，其中與新疆株（MH079424））同源性為99.6%，與山西株（MK213073）同源性為99.3%。

圖3 同源性比較結果

構建的遺傳進化樹（圖4）顯示：邊緣革蜱COI基因與新疆株（HM193889）位于同一分支上，進化關系較近，與另一新疆株（HM193890）關系稍遠；草原革蜱COI基因與新疆株（KF583573）位于同一分支，進化關系較近；森林革蜱COI基因與新疆株（MH079424）和山西株（MK213073）分屬兩個分支，進化關系稍遠。以上3 種鑒定的革蜱COI基因與璃眼蜱屬小亞璃眼蜱株的進化關系較遠。

圖4 COI 基因系統進化樹

3 討論

蜱類研究主要包括：探索蜱類自身功能（生物學特征、生理學特征、媒介潛能等），掌握“蜱類-宿主-疾病”關系（分子生物學等），以及防治蜱及蜱傳疾病（化學、免疫學、物理學或其他）三個方面，但無論在哪個方面，準確鑒定蜱種是蜱類研究的先決條件和基礎[11]。

形態學鑒定的優勢在于，可以很清晰地觀察到蜱的細微結構（假頭基、軀體、盾板、頸溝和側溝、肢節IV、氣門板等），耗時較短，對實驗設備及檢測人員能力要求較低，缺點是準確性較低，容易混淆。分子生物學檢測與形態學鑒定相比，靈敏度和特異性均顯著提高，缺點是耗時較長，對實驗設備及檢測人員能力要求較高。硬蜱屬特征明顯，易于區分，而硬蜱種間存在遺傳變異。隨著人們對生物大分子的深入理解，分子生物學方法在準確鑒定物種方面發揮了重要作用，甚至是推動醫學檢驗發展的重要力量[12]。本研究從和靜縣5 個馬場采集了830 只蜱，通過體式顯微鏡和數碼光學顯微鏡初步鑒定出邊緣革蜱、草原革蜱、森林革蜱等3 種硬蜱；通過分子生物學（PCR 技術）鑒定，經同源性比較發現，這3 種硬蜱與同種蜱基因序列同源性達99.0%以上。進化分析發現，本次鑒定的邊緣革蜱、草原革蜱分別與新疆境內的同種革蜱聚類為同一分支，但均與國內其他地區的蜱種分處于不同的遺傳進化分支；森林革蜱與新疆境內及國內其他地區的森林革蜱處于不同的進化分支。這說明以上3 種蜱中，邊緣革蜱、草原革蜱具有較完整的遺傳進化特征，而森林革蜱遺傳進化特征不夠完整。此數據可為地方蜱及蜱媒病防治奠定基礎。