鮮乳中抗生素殘留微生物檢測(cè)技術(shù)研究

胡燕玲，陳亞波

（中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東中山 528400）

鮮乳由于營養(yǎng)豐富被稱為“白色血液”，是人們尤其是嬰幼兒的主要營養(yǎng)品，對(duì)鮮乳安全問題影響最大的是抗生素殘留。隨著夏行昊[1]、李惠[2]、王宏博[3]和陶利明等[4]對(duì)牛奶及乳制品中抗生素殘留危害相關(guān)問題的研究報(bào)道，近些年多個(gè)省市（浙江省、遼寧省、廣州市、昆明市、貴陽市和烏魯木齊市等）[5-10]對(duì)鮮乳及奶類食品中的抗生素殘留進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同批次的奶類食品中均有檢出抗生素殘留陽性。鮮乳及其乳制品中抗生素殘留問題日益受到關(guān)注。目前，鮮乳中抗生素殘留的檢測(cè)方法有儀器法[11-13]、免疫法[14-16]、和微生物學(xué)法[17-19]。這3種方法中，儀器法需要有大型儀器設(shè)備，并且檢測(cè)程序復(fù)雜、檢測(cè)費(fèi)用較高；免疫法在檢測(cè)過程中很容易受外界因素的影響，適合實(shí)驗(yàn)室樣品量少的研究實(shí)驗(yàn)；微生物檢測(cè)方法不需要大型儀器、操作簡單和成本低廉，是目前實(shí)驗(yàn)室、牧場(chǎng)和企業(yè)中應(yīng)用較廣泛的方法[20]。

本文通過采用利普斯50（E50）試劑盒快速檢測(cè)與國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.27—2008[21]微生物法進(jìn)行檢測(cè)比對(duì)，建立起完善的鮮乳中抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)。有利于加強(qiáng)廣東省中山市乳制品的監(jiān)管，杜絕有抗奶流入市場(chǎng)，保證乳及乳制品的質(zhì)量安全，減少經(jīng)濟(jì)損失和人身傷害。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

利普斯50（E50）抗生素檢測(cè)試劑盒、4% 2,3,5-氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液、溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基、青霉素G鉀鹽、磷酸鹽緩沖液（PBS）等均購于北京陸橋；無抗生素的脫脂乳購于超市。

1.2 儀器與設(shè)備

HVA-85高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司）；KB400生化培養(yǎng)箱[賓德亞太（香港）有限公司]；LSC-316C冰箱（浙江星星家電股份有限公司）；帶蓋恒溫水浴鍋；JY20002電子天平；10～100 μL微量移液器（德國普蘭德公司）；QL-861旋渦混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；L400離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

嗜熱鏈球菌（IFFI 6038）和嗜熱脂肪芽胞桿菌卡利德變種（GIM1.543）購自廣東省微生物菌種儲(chǔ)藏中心。

1.4 嗜熱鏈球菌菌液的配制

挑取新鮮培養(yǎng)物嗜熱鏈球菌接種無菌脫脂乳，按照GB/T 4789.27—2008[21]中第6.2條規(guī)定配制測(cè)試菌液。注意嗜熱鏈球菌如果是超低溫冰箱保存，要先肉湯復(fù)蘇后劃營養(yǎng)瓊脂純化確定活性后才能用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞懸液及測(cè)試培養(yǎng)基的配制

按照GB/T 4789.27—2008第12.1和12.2條規(guī)定配制嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞懸液及測(cè)試培養(yǎng)基的制備。配制過程中需要注意以下幾點(diǎn)：嗜熱脂肪芽胞桿菌需在營養(yǎng)瓊脂平板上反復(fù)純化兩次，挑取新鮮培養(yǎng)的單個(gè)菌落劃營養(yǎng)瓊脂平板與（36±6）℃培養(yǎng)3～ 4 d；嗜熱脂肪芽胞桿菌的芽胞要經(jīng)鏡檢高達(dá)95%以上才能進(jìn)行芽胞懸浮液的配制；測(cè)試培養(yǎng)基分裝小管時(shí)，做好小管口密封防止水分蒸發(fā)；涉及標(biāo)準(zhǔn)菌株操作要遵循實(shí)驗(yàn)室生物安全制度，在二級(jí)生物實(shí)驗(yàn)室安全柜里操作。

1.6 加標(biāo)檢測(cè)乳液制備

在精確度為0.000 1 g天平上稱取青霉素G鉀鹽標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，先用適量無菌磷酸鹽緩沖液溶解，再將該溶液用無菌的無抗生素的脫脂奶稀釋，取含青霉素G鉀鹽標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1 μg·mL-1，0.1 μg·mL-1，0.008 μg·mL-1，0.006 μg·mL-1，0.005 μg·mL-1， 0.004 μg·mL-1，0.003 μg·mL-1。

1.7 實(shí)驗(yàn)原理與檢測(cè)

1.7.1 利普斯50（E50）抗生素檢測(cè)試劑盒原理與檢測(cè)

（1）原理。利普斯50的檢測(cè)基于細(xì)菌生長抑制的原理。當(dāng)微孔板放置于65 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)時(shí)，孢子萌發(fā)，細(xì)菌生長并代謝產(chǎn)生酸使得瓊脂的酸堿度降低，從而導(dǎo)致瓊脂中酸堿指示劑由藍(lán)色（紫色）變?yōu)槲ⅫS色。如果待檢的乳樣品中含有高于檢出限的抗生素殘留，則微生物生長被抑制，瓊脂中的顏色不發(fā)生變化。

（2）檢測(cè)。取出實(shí)驗(yàn)所需要的微孔板，垂直撕開微孔板上保護(hù)箔膜，每孔加入50 μg·mL-1樣品，每個(gè)樣品做三孔平行檢測(cè)，同時(shí)作陰性和陽性對(duì)照。用黏性膠膜封好板孔，放置于65 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2.75 h。觀察時(shí)從微孔側(cè)面觀察檢測(cè)結(jié)果，以標(biāo)準(zhǔn)比色卡為參照，顯藍(lán)色為陽性，顯黃色為陰性，非藍(lán)非黃的為可疑結(jié)果，需進(jìn)行復(fù)檢。

1.7.2 嗜熱鏈球菌抑制法（傳統(tǒng)TTC法）原理與檢測(cè)

（1）原理。按照GB/T 4789.27—2008第2條規(guī)定，待測(cè)試樣品經(jīng)過80 ℃殺菌后，加入預(yù)先制備的嗜熱鏈球菌液。36 ℃培養(yǎng)2 h后，嗜熱鏈球菌開始增長繁殖。加入代謝底物4% 2,3,5-氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液顯色劑，若該樣品中不含有抗生素或抗生素的濃度低于檢測(cè)限，嗜熱鏈球菌繼續(xù)增殖，反應(yīng)還原TTC成為紅色物質(zhì)。反之，若樣品中含有高于檢測(cè)限的抑制劑，則嗜熱鏈球菌生長受抑制，TTC不發(fā)生還原反應(yīng)，樣品保持原來顏色不變。

（2）檢 測(cè)。按 照GB/T 4789.27—2008第6.3條的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，并做陰陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，同時(shí)注意加入測(cè)試液及TTC顯色劑時(shí)要輕搖或渦旋15 s混勻，所有實(shí)驗(yàn)管放置在36 ℃水浴避光培養(yǎng) 30 min，立即觀察其顏色變化。若顏色無變化，于水浴中繼續(xù)避光培養(yǎng)30 min進(jìn)行最終觀察。觀察時(shí)要快速，最好關(guān)燈觀察，避免光照過久干擾。TTC指示劑配制一定要避光，實(shí)驗(yàn)過程中也要避光操作，盡量減少假陽性的結(jié)果。

結(jié)果觀察與判讀：在白色背景前觀察，試管中樣品呈乳的原色時(shí)，表示指示乳中有抗生素存在，結(jié)果為陽性。若試管中樣品呈紅色，則為陰性。如試管顏色變化無法判定，則為可疑結(jié)果，需重新檢測(cè)。

1.7.3 嗜熱脂肪芽胞菌抑制法原理與檢測(cè)

（1）原理。培養(yǎng)基預(yù)先混合嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞，并含有pH指示劑（溴甲酚紫）。加入樣品并孵育后，若該樣品中不含有抗生素或抗生素的濃度低于檢測(cè)限，細(xì)菌芽胞將在培養(yǎng)基中生長并利用糖產(chǎn)酸，pH指示劑由紫色變?yōu)辄S色。反之，如果樣品中含有高于檢測(cè)限的抗生素，則細(xì)菌芽胞不會(huì)生長，pH指示劑的顏色保持不變，仍為紫色。

（2）檢測(cè)。按照GB/T 4789.27—2008第12.3條的標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，注意同時(shí)做陰陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)管置于（65±2）℃水浴培養(yǎng)2.5 h，觀察培養(yǎng)基的變化。若實(shí)驗(yàn)管顏色沒有變化，需在水浴中培養(yǎng)30 min再進(jìn)行最終觀察。

結(jié)果判讀：在白色背景前從側(cè)面和底部觀察小試管內(nèi)培養(yǎng)基顏色。培養(yǎng)基顏色為紫色判讀為陽性結(jié)果，培養(yǎng)基變成黃色或黃綠色判讀為陰性結(jié)果，顏色處于二者之間，則為可疑結(jié)果。出現(xiàn)可疑結(jié)果應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)30 min再進(jìn)行最終觀察。若培養(yǎng)基顏色仍然處于黃色和紫色之間，仍為可疑結(jié)果，表示抗生素濃度接近方法的最低檢出限，需重新檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種檢測(cè)方法加標(biāo)測(cè)試所取得的結(jié)果

利普斯50（E50）、嗜熱鏈球菌抑制法（傳統(tǒng)TTC法）和嗜熱脂肪芽胞菌抑制法檢測(cè)加標(biāo)乳液抗生素殘留的檢測(cè)結(jié)果如表1所示。利普斯50（E50）、嗜熱鏈球菌抑制法（傳統(tǒng)TTC法）和嗜熱脂肪芽胞菌抑制法在鮮乳中抗生素殘留檢測(cè)結(jié)果一致。

表1 3種檢測(cè)方法加標(biāo)測(cè)試所取得的結(jié)果比較

2.2 實(shí)際樣品檢測(cè)

通過從市面上隨機(jī)購買61批牛奶樣品，其中低溫保存鮮牛奶10批，散裝水牛奶4批，乳粉2批（按照奶粉說明用無菌水配制后進(jìn)行檢測(cè)），常溫保存純牛奶45批。分別采用利普斯50（E50）試劑盒、國標(biāo)嗜熱鏈球菌抑制法（傳統(tǒng)TTC法）和嗜熱脂肪芽胞菌抑制法進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明61批牛奶樣品的抗生素殘留檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說明市面上銷售的牛奶及奶制品中抗生素殘留是比較安全的。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用利普斯50（E50）法得到的檢測(cè)結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.27—2008中嗜熱鏈球菌抑制法（傳統(tǒng)TTC法）和嗜熱脂肪芽胞菌抑制法一致。國家標(biāo)準(zhǔn)嗜熱鏈球菌抑制法（傳統(tǒng)TTC法）只適用于鮮乳檢測(cè)，試管顏色變化很容易判讀為假陽性；嗜熱脂肪芽胞菌抑制法雖然適用于鮮乳、復(fù)原乳、消毒滅菌乳和乳粉中抗生素檢測(cè)，但是實(shí)驗(yàn)前標(biāo)準(zhǔn)菌株的優(yōu)質(zhì)保存、活化、測(cè)試菌液制備、芽孢懸液制備及測(cè)試培養(yǎng)基制備等耗時(shí)長，對(duì)檢驗(yàn)人員技術(shù)熟練度要求較高。利普斯50（E50）方法適合鮮乳及乳制品中抗生素殘留的檢測(cè)，其操作步驟簡單方便，2.75 h出結(jié)果，檢測(cè)量大，快速高效，一般檢驗(yàn)員都能進(jìn)行檢驗(yàn)操作，可作為鮮乳中抗生素殘留檢測(cè)首選快速檢測(cè)法，值得在奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)、鮮乳制品企業(yè)和檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)中推廣應(yīng)用。