一測多評法定量分析半夏及其混偽品中的4種核苷類成分

王翠翠，畢啟瑞，張建青，楊 琳，姚 帥，果德安*

一測多評法定量分析半夏及其混偽品中的4種核苷類成分

王翠翠1, 2，畢啟瑞2，張建青2，楊 琳2，姚 帥2，果德安1, 2*

1. 南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023 2. 中國科學院上海藥物研究所，中藥標準化技術國家工程研究中心，上海 201203

建立一測多評法測定半夏及其混偽品天南星、水半夏和虎掌南星中尿苷、腺嘌呤、鳥苷及腺苷的含量方法。利用高效液相色譜法，采用Shim-pack Scepter C18-120色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相10%乙腈-水，梯度洗脫；體積流量1 mL/min；檢測波長260 nm；柱溫20 ℃。以腺苷為內標，建立尿苷、腺嘌呤和鳥苷的相對校正因子，同時采用外標法和一測多評法測定多批次藥材中4種成分的含量，驗證一測多評法的準確性和可行性。尿苷、腺嘌呤、鳥苷及腺苷在各自線性范圍內線性關系良好（＞0.999 9），平均加樣回收率95.40%～104.02%，一測多評法和外標法測得的含量無顯著差異（RSD＜3%），不同產地的半夏中4種核苷含量顯示有明顯差異。除天南星外，基于核苷的含量測定結果結合化學計量分析可以很好地區分半夏、水半夏和虎掌南星。該方法簡便準確度高，可為半夏的質量控制和評價提供參考。

一測多評；半夏；天南星；水半夏；虎杖南星；混偽品；核苷；化學計量分析

半夏是天南星科植物半夏(Thunb.) Breit.的干燥塊莖，有毒，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結等功效[1]。有報道表明核苷類成分為半夏降逆止嘔的主要藥效物質[2]，核苷類成分藥理作用廣泛，不僅是許多物質的代謝前體，而且在細胞生理學中也發揮多重作用[3]。現階段半夏的檢測與定量多集中于生物堿、有機酸和核苷類成分，關于半夏混偽品的含量測定報道較少，且上述含量測定多采用外標法[2,4-5]，鮮有一測多評法用于半夏中核苷類成分的測定。一測多評法（quantitative analysis of multi-components by a single marker ，QAMS）在被《中國藥典》2010年版收錄，并在美國藥典和歐盟藥典的中草藥標準中得到廣泛應用，大量文獻研究報道了一測多評法的驗證及其在中藥分析和標準中的應用[6-9]。本實驗采用高效液相色譜法，建立了一測多評法測定半夏、天南星、水半夏和虎掌南星中尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷4種核苷類成分的含量，為半夏的質量控制和評價提供了參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀（Agilent G7111B四元泵，Agilent G7129A進樣器，Agilent G7115A DAD檢測器）；P180H型超聲波水浴鍋（德國埃爾瑪公司）；A-14型離心機（賽多利斯北京有限公司）；Secura 125-1CN型電子天平（賽多利斯北京有限公司）；Quintix 224-1CN型電子天平（賽多利斯北京有限公司）；Milli-Q Integral型超純水系統（Millipore，Bedford公司，美國）。

1.2 試劑與藥材

對照品尿苷（批號8041，質量分數97.2%）、腺嘌呤（批號5815，質量分數99.6%）、鳥苷（批號3877，質量分數≥98.0%）、腺苷（批號5747，質量分數99.3%）均購于上海詩丹德標準技術服務有限公司，半夏對照藥材（批號121272-201806）購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈（質譜級，Honeywell，批號UCCAIH），超純水。

11批半夏、5批水半夏、5批虎掌南星、3批天南星均來源于市售及飲片生產廠家（表1），并經上海藥物研究所中藥標準化技術國家工程研究中心姚帥高級實驗師鑒定為天南星科半夏屬植物半夏(Thunb.) Breit.的干燥塊莖，天南星為天南星科植物天南星(Wall.) Schott的干燥塊莖，水半夏為天南星科犁頭尖屬植物鞭檐犁頭尖(Lodd.) Blume.的干燥塊莖，虎掌南星為天南星科植物虎掌Schott的干燥塊莖。

表1 樣品信息

Table 1 Information of samples

樣品名稱樣品編號產地收集時間生產廠家 半夏湖北湖北2020-07伊春五加參藥業有限責任公司 半夏河南1河南2020-07伊春五加參藥業有限責任公司 半夏河南2河南2020-07伊春五加參藥業有限責任公司 半夏河南3河南2020-07伊春五加參藥業有限責任公司 半夏河南4河南2020-07伊春五加參藥業有限責任公司 半夏山東1山東2020-07伊春五加參藥業有限責任公司 半夏山東2山東2020-07伊春五加參藥業有限責任公司 半夏山東3山東2020-07伊春五加參藥業有限責任公司 半夏山東4山東2020-07伊春五加參藥業有限責任公司 半夏山東5山東2020-07伊春五加參藥業有限責任公司 半夏河北河北2021-11市售 虎掌南星虎掌1安徽2021-11市售 虎掌南星虎掌2安徽2021-11市售 虎掌南星虎掌3河北2021-11市售 虎掌南星虎掌4貴州2021-11市售 虎掌南星虎掌5云南2021-11市售 水半夏水半夏1四川2021-11市售 水半夏水半夏2甘肅2021-11市售 水半夏水半夏3甘肅2021-11市售 水半夏水半夏4四川2021-12市售 水半夏水半夏5江西2021-12市售 天南星天南星1河北2021-11市售 天南星天南星2河北2021-11市售 天南星天南星3湖北2021-12市售

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Shim-pack Scepter C18-120色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水（A）-10%乙腈（B），梯度洗脫：0～10 min，83%～80% A，10～20 min，80%～40% A；20～30 min，40%～0 A；體積流量1 mL/min；檢測波長260 nm；柱溫20 ℃；進樣量20 μL。混合對照品和半夏樣品的高效液相色譜圖（HPLC）如圖1所示。

1-尿苷 2-腺嘌呤 3-鳥苷 4-腺苷

2.2 混合對照品溶液的制備

取尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷對照品適量，精密稱定，加水制成含尿苷11.01 μg/mL、腺嘌呤7.86 μg/mL、鳥苷17.86 μg/mL、腺苷11.78 μg/mL的混合對照品儲備液，4 ℃冰箱保存備用。

2.3 供試品溶液的制備

取半夏粉末（過4號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水25 mL，稱定質量，超聲處理（功率1130 W、頻率37 kHz）30 min，冷卻至室溫，再稱定質量，用純水補足減失的質量，搖勻后12 000 r/min離心10 min，經0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 分別精密吸取尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷對照品溶液及混合對照品溶液、半夏對照藥材溶液和供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定。色譜峰的先后順序為尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷，單一對照品溶液、混合對照品溶液、半夏對照藥材溶液和供試品溶液的保留時間和最大紫外吸收波長一致，表明方法專屬性良好。

2.4.2 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品儲備液0.2、0.4、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于5 mL量瓶中，加水定容至刻度，混勻。分別精密吸取上述系列溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。以4種對照品的質量濃度為橫坐標（），峰面積為縱坐標（）繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數（），4個成分在相應的質量濃度范圍內線性關系良好，結果見表2。

表2 4個分析物的回歸方程、線性范圍、相關系數

Table 2 Regression equation, linear range and correlation coefficient of four compositions

成分回歸方程r線性范圍/(μg·mL?1) 尿苷Y＝46.385 X＋0.407 80.999 92 0.44～11.01 腺嘌呤Y＝109.71 X＋0.170 60.999 920.31～7.86 鳥苷Y＝43.288 X＋1.303 80.999 92 0.71～17.86 腺苷Y＝63.329 X＋1.002 90.999 92 0.47～11.78

2.4.3 儀器精密度試驗 精密吸取“2.2”項下對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定5次，測得尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷峰面積RSD分別為0.11%、0.08%、0.04%、0.10%。

2.4.4 中間精密度試驗 在不同日期、由不同人員分別取同一批樣品（河南1）3份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，使用不同的3臺高效液相色譜儀測定含量，3次實驗測得尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷的含量的RSD分別為0.85%、1.53%、0.71%、0.66%。

2.4.5 重復性試驗 取同一批樣品（河南1）6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，測得尿苷、腺嘌呤、鳥苷、腺苷含量的RSD分別為0.81%、0.54%、0.50%、0.52%。

2.4.6 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液和對照品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、10、12、18、24 h按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測得供試品溶液中尿苷、腺嘌呤、鳥苷、腺苷的峰面積RSD分別為2.52%、2.95%、1.67%、1.37%，保留時間RSD分別為0.42%、0.30%、0.32%、0.30%；對照品溶液中尿苷、腺嘌呤、鳥苷、腺苷的峰面積RSD分別為0.15%、0.20%、0.17%、0.24%，保留時間RSD分別為0.44%、0.24%、0.23%、0.08%。

2.4.7 加樣回收率試驗 精密稱取已測定的半夏藥材粉末9份，每份0.5 g，分別加入低、中、高濃度對照品溶液（低、中、高濃度對照品加入量與所取供試品中待測成分含量之比分別為0.5∶1、1∶1、1.5∶1），制備低、中、高3種濃度的供試品溶液，每個濃度平行制備3份樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算回收率，尿苷、腺嘌呤、鳥苷、腺苷的加樣回收率分別為98.50%、104.02%、101.38%、95.40%，RSD值分別為0.79%、1.39%、1.71%、3.29%。

2.4.8 耐用性考察 考察了不同色譜柱（Shim-pack GIST C18-AQ、Shim-pack Scepter C18-120）、流動相初始比例（16%、17%、18%）、體積流量（1.1、0.9、1.0 mL/min）和檢測波長（263、257、260 nm）對該方法的影響，測得4種成分的含量的RSD為0.02%～3.18%，表明方法耐用性良好。

2.5 相對校正因子計算

本實驗采用斜率法[7]，以腺苷為內參物。計算公式為f/s=a/s，式中為相對校正因子，s為內參成分斜率，a為待測成分斜率。按“2.4.2”項下方法制備3條標準曲線，4種核苷的3條標準曲線的均大于0.999 8，再計算斜率得到相對校正因子，結果見表3。

表3 半夏中尿苷、腺嘌呤、鳥苷、腺苷的相對校正因子

Table 3 Conversion factors of uridine, adenine, guanosine, and adenosine in Pinelliae Rhizoma

標準曲線f尿苷/腺苷f腺嘌呤/腺苷f鳥苷/腺苷 標曲11.3720.5791.461 標曲21.3650.5771.463 標曲31.3950.5661.463 均值1.3800.5701.460 RSD/%1.1301.2800.080

2.6 相對校正因子重復性考察

考察了3臺高效液相色譜儀和2種不同色譜柱對校正因子的影響，結果顯示尿苷、腺嘌呤、鳥苷對腺苷的相對校正因子和相對保留時間RSD均小于1.0%，表明使用不同儀器及色譜柱均具有良好的重現性，結果見表4。

表4 不同色譜儀和色譜柱的相對校正因子和相對保留時間

Table 4 Conversion factors and relative retention times at different instruments and different columns

儀器/色譜柱f尿苷/腺苷f腺嘌呤/腺苷f鳥苷/腺苷tR尿苷/腺苷tR腺嘌呤/腺苷tR鳥苷/腺苷 Agilent 1260 Infinity II1.3720.5791.4610.3730.6570.732 Agilent 1260 Infinity1.3790.5831.4630.3720.6580.732 Agilent 1260 Infinity II1.3840.5841.4520.3650.6510.725 RSD/%0.8500.1500.8500.1600.2500.270 Shim-pack GIST C18-AQ1.3730.5781.4760.3780.6820.728 Shim-pack Scepter C18-1201.3690.5751.4600.3780.6820.728 RSD/%0.2000.3100.7400.0000.0000.000

2.7 一測多評法與外標法多批次樣品測定結果比較

取不同批次半夏、天南星、水半夏和虎掌南星，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，每種樣品平行制備2份，計算平均含量。按“2.1”項下色譜條件分別采用外標法、一測多評法測定含量，見表5。結果2種方法測定結果無顯著差異，表明一測多評法具有較高可信度。

2.8 化學計量學分析

本實驗用半夏及其混偽品的多批次樣品建立化學計量分析的共有模式，4個核苷類成分作為化學計量學分析的變量，統計匯總24批藥材中4種核苷的含量，使用SIMCA 14.0和Origin 2022軟件進行主成分分析和分層聚類熱圖分析。

結果如圖2所示，結果表明，水半夏、虎掌南星和半夏、天南星可以較好地區分，半夏與天南星的區分較差，其中半夏的聚類可根據產地大致分為2類，左上角5批半夏的產地均為中部地區，右下角6批半夏的產地均為東部地區。水半夏含有的4種核苷總量較少，為0.081～0.176 mg/g，虎掌南星的總質量分數為0.507～0.905 mg/g，在4種藥材中總核苷質量分數最多，這與夏成凱等[10]的研究結果一致，半夏和天南星的核苷總量分別為0.428～0.561 mg/g和0.377～0.493 mg/g。分層聚類熱圖可將水半夏、虎掌南星、中部地區半夏、天南星和東部地區半夏很好地聚成5類，與主成分分析結果一致，其中虎掌南星的腺苷含量較少，水半夏整體核量較少，中部半夏腺苷和鳥苷含量較高，天南星和東部半夏鳥苷含量較高。

表5 半夏、天南星、水半夏和虎掌南星中4種成分的含量測定結果（n＝2）

Table 5 Contents of four components in Pinelliae Rhizoma, Arisaematis Rhizoma, tubers of T. flagelliforme and P. pedatisecta by external standard methods and QAMS (n＝2)

樣品名稱尿苷/(mg·g?1)腺嘌呤/(mg·g?1)鳥苷/(mg·g?1)腺苷/(mg·g?1) 外標法QAMSRSD/%外標法QAMSRSD/%外標法QAMSRSD/%外標法 河南10.1190.1200.790.0810.0792.120.1800.1761.480.121 河南20.0780.0790.790.0720.0702.120.1680.1651.480.123 河南30.0880.0890.790.0850.0832.120.1830.1801.480.116 河南40.0790.0800.790.0680.0662.120.1560.1531.480.129 湖北0.0860.0870.790.0820.0802.120.1660.1621.480.109 河北0.1390.1410.790.1110.1082.120.1880.1841.480.061 山東10.1620.1640.790.1060.1032.120.1930.1891.480.051 山東20.1860.1880.790.1140.1102.120.2110.2071.480.056 山東30.1670.1690.790.1020.0992.120.1990.1951.480.068 山東40.1650.1670.790.0990.0962.120.1920.1881.480.062 山東50.1780.1800.790.1010.0982.120.1790.1761.480.063 天南星10.1080.1090.790.0940.0912.120.1300.1281.480.049 天南星20.1700.1720.790.1060.1032.120.1560.1531.480.065 天南星30.1070.1080.790.0930.0912.120.1490.1461.480.076 虎掌10.2650.2680.790.1190.1162.120.1840.1811.480.027 虎掌20.2820.2860.790.1210.1172.120.1750.1721.480.024 虎掌30.4520.4570.790.1180.1152.120.1580.1551.480.026 虎掌40.5080.5140.790.1660.1612.120.2210.2171.480.013 虎掌50.3170.3200.790.0910.0892.120.0930.0911.480.008 水半夏10.0540.0540.790.0410.0402.120.0210.0201.480.033 水半夏20.0470.0480.790.0270.0262.120.0000.0000.000.008 水半夏30.0580.0580.790.0590.0572.120.0290.0281.480.033 水半夏40.0280.0290.790.0360.0352.120.0120.0121.480.006 水半夏50.0340.0340.790.0320.0322.120.0100.0101.480.028

3 討論

本實驗通過單因素實驗考察了提取溶劑（水、20%甲醇、50%甲醇、甲醇）、提取方式（超聲、回流）、超聲時間（15、30、45、60 min）、提取體積（10、25、50 mL）和提取次數（1、2次），綜合考慮提取效率和操作的簡便性，最終選擇25 mL水超聲30 min。

考察了不同色譜柱（Waters Atlantis T3、Kromasil Eternity XT-5-C18、Shim-pack GIST C18-AQ、Shim-pack Scepter C18-120）和流動相（乙腈-水、甲醇-水、10%乙腈-水、10%乙腈-0.1%甲酸水、10%乙腈-0.1%磷酸水），綜合考慮理論塔板數、分離度和拖尾因子，最終選擇Shim-pack Scepter C18-120色譜柱及10%乙腈-水。乙腈的峰形優于甲醇，同時考慮到方法在其他儀器上的重現性，故選擇10%乙腈作為流動相。因尿苷和腺苷的最大吸收波長為260 nm，鳥苷和腺嘌呤的最大吸收波長分別為252 nm和262 nm，故選擇260 nm的檢測波長。

在建立腺苷與其余3種成分間的相對校正因子的評價中，本實驗考察了不同色譜柱、不同儀器，結果表明一測多評法與外標法測得的含量值之間沒有顯著性差異，表明建立的校正因子具有較好的可信度。根據內標峰的保留時間、相對保留時間和最大紫外吸收波長，能夠準確判斷目標峰的位置，結果表明，利用上述方法進行峰的定位可行。

圖2 半夏及其混偽品的4種核苷含量主成分分析圖(A)、HPLC圖(B) 和4種核苷含量分層聚類熱圖(C)

主成分分析結果表明，水半夏聚落較為緊湊，而半夏、天南星和虎掌南星的聚落較為分散，整體離散度較大，這可能與其產地不同有關，不同土壤及氣候對藥材中核苷的含量影響較大。11批半夏的尿苷質量分數為0.079～0.188 mg/g，腺嘌呤質量分數為0.066～0.110 mg/g，鳥苷質量分數為0.153～0.207 mg/g，腺苷質量分數為0.051～0.129 mg/g，在張勇等[11]測得的12批半夏中相應的4種核苷含量范圍內，與王朋展等[12]測定的7批半夏的腺嘌呤、鳥苷和腺苷含量范圍一致。3批天南星的4種核苷含量與夏成凱等[10]測定的1批天南星相比，后者尿苷含量低于本實驗測得范圍，腺苷含量在本實驗范圍內，沒有檢測到鳥苷，王朋展等[12]測定的1批天南星沒有檢測到腺苷，測得的腺嘌呤、鳥苷和尿苷的含量均高于本實驗所測；5批水半夏測得的4種核苷含量均低于王朋展等[12]和夏成凱等[10]測定的1批水半夏；王朋展等[12]測定了3批虎掌南星，夏成凱等[10]測定了1批虎掌，尿苷、腺嘌呤和鳥苷的含量均在本實驗測定的5批虎掌南星的范圍內，但腺苷含量均高于本實驗，而甄子萱等[13]測得的4批掌葉半夏的腺苷含量在本實驗范圍內。導致上述差異的原因可能為產地不同，同時樣品批次過少，測定結果有待多批次驗證。

隨著市場需求的增加、野生資源的減少及栽培技術的落后[14-15]，市場流通中混有大批半夏同科近緣品種[10, 12]。半夏及其3個混偽品天南星、水半夏和虎掌南星的傳統鑒定方法主要包括性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜、指紋圖譜、紅外光譜和DNA條形碼[16-19]，本實驗通過主成分分析和分層聚類熱圖分析，依據4種核苷含量可以很好地區分半夏、水半夏和虎掌南星，但不能鑒別天南星和半夏。同時半夏產地較廣，不同產地對核苷含量影響較大，樣本量越大化學計量分析結果可信度越高，本研究的實驗結果有待進一步廣泛收集樣本進行驗證。綜上，本實驗建立的一測多評法在測定半夏中的尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷的含量時具有較高的重現性、穩定性和可靠度，并能應用到半夏混偽品水半夏、天南星和虎掌南星的區分，為半夏的質量控制提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quantitative analysis of four nucleosides inand its adulterants by the quantitative analysis of multi-components by a single marker

WANG Cui-cui1, 2, BI Qi-rui2, ZHANG Jian-qing2, YANG Lin2, YAO Shuai2, GUO De-an1, 2

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. National Engineering Research Center of TCM Standardization Technology, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China

To establish a method for the determination of uridine, adenine, guanosine and adenosine inand its adulterants, including, tubers ofandby quantitative analysis of multi-components by a single marker (QAMS).The nucleosides were analyzed in Shim-pack Scepter C18- 120 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) by high performance liquid chromatography (HPLC); The gradient elution was carried out with the mobile phase composed of 10% acetonitrile-water at the flow rate of 1 mL/min and the detection wavelength of 260 nm, column temperature at 20 ℃. Adenosine was used as the internal reference substances to establish the conversion factors of uridine, adenine and guanosine. At the same time, the contents of multiple batches of medicinal materials were determined by external standard method and QAMS to verify the accuracy and feasibility of QAMS.The results showed that uridine, adenine, guanosine and adenosine had good linear relationship in the ranges of the tested concentrations (＞0.999 9), and the average recoveries were 95.40%-104.02%. There was no significant difference in the contents of uridine, adenine, guanosine and adenosine measured by QAMS and external standard method (RSD＜3%). The contents of four kinds of nucleosides infrom different habitats showed significant variations. Except for,, tubers ofandcould be distinguished by the content of nucleoside combined with chemometrics. Conclusion The method has high accuracy and simple, which can provide a reference for the quality evaluation and control of.

single standard to determine multi-components;(Thunb.) Breit.;(Wall.) Schott;(Lodd.) Blume.;Schott; adulterants; nucleosides; chemometrics

R286.2

A

0253 - 2670(2022)19 - 6180 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.024

2022-03-09

國家自然科學基金重點項目（82130111）；國家自然科學基金青年項目（82003940）

王翠翠（1998—），女，碩士研究生，研究方向為中藥質量標準研究。Tel: 18337682088 E-mail: 20190392@njucm.edu.cn

果德安，研究員，博士生導師，主要從事中藥化學與現代質量標準研究。Tel: (021)50271516 E-mail: daguo@simm.ac.cn

[責任編輯 時圣明]