山茱萸CoHMGR基因的亞細胞定位和表達分析

王瑤瑤，凡貞潔，李 炯，劉曉冉，王 龍，張佳琪，胥華偉，侯小改*，侯典云*

山茱萸基因的亞細胞定位和表達分析

王瑤瑤1, 2，凡貞潔1, 2，李 炯3，劉曉冉1, 2，王 龍1, 2，張佳琪1, 2，胥華偉1, 2，侯小改1, 2*，侯典云1, 2*

1. 河南科技大學農學院，河南 洛陽 471023 2. 洛陽市道地藥材繁育與創新利用工程技術研究中心，河南 洛陽 471023 3. 河南省農業農村廳中藥材生產技術服務中心，河南 鄭州 450000

研究山茱萸基因編碼蛋白質的亞細胞定位以及不同濃度的外源激素對基因表達和活性成分含量的影響。農桿菌菌液侵染煙草葉片，激光共聚焦倒置顯微鏡觀察CoHMGR蛋白的亞細胞定位。不同濃度的茉莉酸甲酯和乙烯利噴施山茱萸2年生幼苗，實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）測定不同時期基因表達水平，高效液相色譜（HPLC）檢測莫諾苷、馬錢苷含量。激光共聚焦顯微鏡下觀察到CoHMGR蛋白定位于內質網中。qPCR和HPLC結果顯示200 μmol/L茉莉酸甲酯和250 mg/L乙烯利對目的基因表達水平和活性成分含量都有正向誘導效應。CoHMGR蛋白定位于內質網，外源噴施200 μmol/L茉莉酸甲酯和250 mg/L乙烯利能顯著提高基因表達量和莫諾苷、馬錢苷含量，為深入解析基因功能奠定基礎。

山茱萸；；亞細胞定位；莫諾苷；馬錢苷；表達分析

山茱萸Sieb. et Zucc.為多年生落葉喬木或灌木，其成熟去核干燥后的果肉入藥，是多種中成藥的主要成分，在河南、山西、甘肅、山東和浙江等省份都廣有分布[1]。山茱萸含有環烯醚萜苷類、黃酮類、三萜類、多糖和鞣質等多種活性物質，其中，環烯醚萜類化合物是山茱萸的特征性物質[2]。山茱萸環烯醚萜化合物種類眾多，具有代表性的是莫諾苷和馬錢苷，越來越多山茱萸環烯醚萜類物質也在不斷的被發掘[3]?，F代醫學研究表明，山茱萸具有多種藥理功能，如從山茱萸中提取的總萜類物質可以有效降低血糖；山茱萸的環烯醚萜總苷既可以降低血糖和調節血脂，又能夠起到抑制血栓形成的作用[4-6]。目前關于山茱萸的研究主要集中在活性成分的挖掘和藥理作用的探究等方面，有關山茱萸萜類合成途徑的研究十分有限，因此從分子生物學的角度解析山茱萸萜類生物合成途徑關鍵基因的功能顯得非常重要。

3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase，HMGR）催化萜類生物合成甲羥戊酸途徑（mevalonic acid，MVA）中的第3步反應，HMGR為該途徑中的第1個限速酶，是調控萜類次生代謝產物合成的關鍵酶[7]。近年來，越來越多來自不同植物的基因被克隆，并對其功能進行了初步驗證[8]。徐曉騰等[9]克隆并分析了人參皂苷合成過程中的重要酶，從多個數據庫進行了注釋分析；郭思遠等[10]克隆了東北雷公藤基因，并對該基因做出了生物信息學分析，預測基因編碼的蛋白質位于內質網中。

本實驗基于課題組前期獲得的山茱萸轉錄組數據＞c100572_g1[11]，構建表達載體，根據基因編碼蛋白在煙草葉片細胞中的熒光位置判斷CoHMGR蛋白的亞細胞定位，同時探究了噴施不同濃度茉莉酸甲酯和乙烯利對山茱萸基因的表達模式及其活性成分含量的影響，為闡明山茱萸萜類物質分子合成途徑提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

山茱萸2年生幼苗種植于河南科技大學農學院試驗田中，由河南科技大學戴攀峰副教授鑒定為山茱萸Sieb. et Zucc.，種植期間水肥管理一致，選取生長狀態基本相同的植株作為外源激素噴施對象，噴施完成后摘取葉片為實驗材料。選取本氏煙草為亞細胞定位的材料。

1.2 儀器

FV3000型激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus公司），5415 R型高速冷凍離心機（Eppendorf公司），紫外-可見光分光光度計來源，JY04S-3D型凝膠成像分析系統（君意電泳公司）等。

2 方法

2.1 山茱萸RNA提取和反轉錄

稱取山茱萸葉片70～80 mg，裝入標記好的滅菌1.5 mL離心管中，球磨儀研磨葉片成粉末，按照諾貝萊RNA提取試劑盒步驟提取山茱萸葉片總RNA，跑膠確認其完整度后，用微量分光光度計測定濃度，再使用艾德萊反轉錄試劑盒根據需要得到一部分用于PCR擴增的cDNA，一部分用于實時熒光定量PCR實驗的cDNA，標記好保存于?20 ℃冰箱備用。

2.2 亞細胞定位表達載體構建

山茱萸基因開放閱讀框全長1731 bp，共編碼576個氨基酸。使用Primer Premier5.0軟件設計引物，去掉開放閱讀框的終止子，在終止子這端添加酶切位點，-F：5’-ATGGACGTTCGCAGGAGACAATCC-3’，- R-Ⅰ：5’-GCAGAGCACCCCTTGCT- TATATC-3’。以山茱萸總RNA反轉錄得到的cDNA為模板擴增出具有Ⅰ酶切位點的基因序列，反應條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、2 min，32個循環；72 ℃、5 min。將該序列連接到pMD18-T載體，轉化至感受態的大腸桿菌DH10B中，選取單菌落搖菌，用上述引物進行菌液PCR擴增篩選陽性菌液送公司測序，序列比對正確后提取質粒備用。用于亞細胞定位實驗的表達載體pCambia1300-GFP保存在大腸桿菌DH10B中，提取質粒備用。因為pMD18-T載體上也有Ⅰ酶切位點，因此采用Ⅰ單酶切的方法同時酶切連接到克隆載體上的序列和pCambia1300-GFP質粒，酶切過后會形成互補的黏性末端，在T4連接酶的作用下，形成新的重組載體pCambia1300- CoHMGR-GFP，按上述步驟轉化到大腸桿菌DH10B中，篩選、測序比對正確后提取質粒進行后續實驗。

構建好的重組質粒pCambia1300-CoHMGR- GFP轉化到感受態農桿菌GV3101中待用；用軟件在線預測CoHMGR蛋白位于內質網，選用ER-HDEL載體作為內質網標記（由南京農業大學張群教授惠贈）。將包含pCambia1300-CoHMGR- GFP質粒的農桿菌、空載pCambia1300-GFP和帶有ER-HDEL標記的農桿菌分別擴大培養搖菌16 h以上，測定菌液的600在0.8～1.0內，就可以收集菌體，再用配制好的注射液重懸菌體，從葉片下表皮注射進煙草葉片內，暗培養兩天后觀察結果。

2.3 外源激素處理

分別配制100、200、400 μmol/L茉莉酸甲酯和250、500、750 mg/L乙烯利溶液。選取生長狀態一致的山幼苗，分別噴施配制好的茉莉酸甲酯和乙烯利，噴施時間為17:30—19:30時，每個處理噴施量為500 mL，分別在噴施后0、1、3、5、7 d時取樣，每株取若干葉片，將每個處理不同株上的葉片混合在一起，采集得到的葉片離體后立即用蒸餾水沖洗干凈，分成3份裝入材料袋，液氮處理后保存至?80 ℃冰箱。

2.4 山茱萸CoHMGR表達量檢測

設計基因的特異性擴增引物用于實時熒光定量PCR實驗：q--F：5’-TG- ACAAGAAGCCAGCAGCAGT-3’、q-- R：5’-GGCATTAAATCCACCAAGAGC-3’。以基因作內參，引物序列為：q-CoGAPDH-F：5’-TATCAAGGAGGAGTCAGAG- G-3’、q-CoGAPDH-R：5’-CCATTCGTTGTCAT- ACCAGG-3’。以“2.1”項方法獲得激素處理后的葉片cDNA為模板，按照SYBR試劑盒說明書操作，每個反應3次重復，檢測不同激素處理下基因隨著時間變化的表達水平，根據相對表達量判斷基因對茉莉酸甲酯和乙烯利的響應情況。

2.5 山茱萸葉片中莫諾苷、馬錢苷含量測定[12]

稱取激素處理后的樣品0.5 g左右，每個樣品3個重復，在裝有研磨珠的10 mL離心管內研磨破碎山茱萸葉片成粉末，從研磨儀中取出離心管后迅速向管內加入80%甲醇，接著用超聲波清洗機提取葉片中的化合物，提取條件為60 ℃、超聲40 min，期間需要振蕩2～3次，提取完成后，4000 r/min、4 ℃離心5 min，無菌針管吸取上清液過有機濾膜到棕色液相小瓶中，蓋緊瓶蓋置于4 ℃冰箱備用。

使用安捷倫高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity）測量制備好的樣品和標品，色譜柱為Hypersil GOLD-Agilent柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）條件為：VWD檢測器，流動相為甲醇-水（25∶75），每個樣品的檢測時間為40 min，檢測波長240 nm，柱溫箱30 ℃，進樣體積10 μL，體積流量1 mL/min，按照上述條件測定樣品及對照。方法學考察參照文獻[12]，RSD值均小于0.5%。

2.6 數據分析

利用Excel處理數據，整理得到激素處理后的CoHMGR表達量和莫諾苷、馬錢苷含量，將數據輸入GraphPad Prism 6作圖，通過SPSS軟件分析不同激素處理下每個時間點內基因表達量、代謝物含量的差異顯著性，采用Pearson相關性分析探究基因表達量和莫諾苷、馬錢苷含量之間的關系。

3 結果與分析

3.1 RNA提取和PCR擴增

按照“2.1”項提及方法獲得的山茱萸葉片總RNA如圖1所示，PCR擴增得到添加了Ⅰ酶切位點的基因序列（圖2）。

M-Marker 1～3-總RNA

M-Marker 1、2-PCR擴增產物

3.2 CoHMGR蛋白的亞細胞定位

剪下注射完農桿菌菌液并且暗培養2 d后的煙草葉片，下表皮朝上放置于載玻片上，蓋玻片輕輕蓋住，排去多余氣泡即可完成制片。將制備好的樣品倒置放在激光共聚焦顯微鏡的載物臺上，觀察煙草葉片下表皮細胞中的熒光信號（圖3），CoHMGR蛋白所發的綠色熒光和ER-HDEL標記的紅色熒光重合，圖片重疊后發出黃色熒光，表明CoHMGR蛋白位于內質網中，與軟件預測結果一致。

A-GFP載體 B-CoHMGR-GFP載體

3.3 茉莉酸甲酯、乙烯利對CoHMGR基因表達的影響

不同濃度茉莉酸甲酯和乙烯利處理后的基因表達水平受到了一定程度的影響，結果顯示（圖4），200 μmol/L的茉莉酸甲酯對基因的誘導效應強于100 μmol/L和400 μmol/L濃度，在處理后的第1天達到最高值比處理前提高了10倍左右，第3、5、7天基因表達量雖然有所下降，但是依然比處理前高出4倍；其余2個濃度的茉莉酸甲酯對基因沒有明顯的誘導作用。250 mg/L的乙烯利對基因的正向誘導作用最大，在處理后的第1天目的基因表達量提高了11倍，接下來幾天其表達水平逐漸平穩，表達量基本是0 d的4倍；500 mg/L和750 mg/L的乙烯利噴施對基因的表達量沒有明顯持續的影響。以上結果證明200 μmol/L的茉莉酸甲酯和250 mg/L的乙烯利對基因都有正向且持續的誘導作用，顯著提高了目的基因的表達水平。

3.4 山茱萸葉片中的活性成分分析

根據激素處理后山茱萸葉片中基因表達水平的檢測結果，選取了200 μmol/L茉莉酸甲酯和250 mg/L乙烯利處理后的樣品，通過高效液相色譜測定這2個處理后山茱萸葉片中的莫諾苷和馬錢苷的含量。結果表明（圖5），葉片中的莫諾苷含量在茉莉酸甲酯的處理后顯著升高，茉莉酸甲酯處理后的第1天莫諾苷含量達到最大值，是處理前的2.28倍，接下來的幾天內莫諾苷的含量雖然低于第1天，但是也顯著高于處理前；乙烯利處理后葉片中的莫諾苷含量動態變化與茉莉酸甲酯處理下相似，先是在第1天就有顯著提升，接著在第3天和第5天含量有所下降，但是在第7天莫諾苷含量達到了最大值，是0 d的1.99倍。激素處理對馬錢苷含量的影響不同于莫諾苷，葉片中的馬錢苷含量在處理后的7 d內呈現逐漸上升的趨勢。茉莉酸甲酯和乙烯利處理后的馬錢苷含量都在第7天達到了最大值，分別是處理前的3.21倍和3.17倍。綜上所述，200 μmol/L茉莉酸甲酯和250 mg/L乙烯利對山茱萸葉片中莫諾苷和馬錢苷的生成都有明顯的促進作用。

CK-對照 M1、M2、M3-100、200、400 μmol·L?1茉莉酸甲酯處理 E1、E2、E3-250、500、750 mg·L?1乙烯利處理 不同小寫字母表示處理間差異顯著（P＜0.05），下同

圖5 激素處理后山茱萸葉片莫諾苷(A) 和馬錢苷(B) 含量

3.5 CoHMGR表達量和莫諾苷、馬錢苷含量相關性分析

對外源激素處理下的目的基因表達量和次生代謝產物莫諾苷、馬錢苷含量進行皮爾遜（Pearson）關性分析，結果如表1所示，表達量和莫諾苷含量之間的相關系數為0.774，說明這兩者之間呈強正相關性，即表達量越高，莫諾苷含量也就越高；但是表達量和馬錢苷含量之間的相關系數僅為0.074，表明這兩者之間相關性極弱；莫諾苷含量和馬錢苷含量之間的相關系數為0.335，說明這兩者之間存在較弱相關性。

表1 激素處理下CoHMGR相對表達量與莫諾苷、馬錢苷含量的相關性

Table 1 Correlation between relative expression of CoHMGR and contents of morronin and loganin under hormone treatment

項目Pearson相關系數 CoHMGR莫諾苷含量馬錢苷含量 CoHMGR1.000 莫諾苷含量 0.774**1.000 馬錢苷含量 0.0740.3351.000

**< 0.01

4 討論

關于HMGR蛋白的亞細胞定位研究的報道較少，擬南芥HMGR蛋白的亞細胞定位結果顯示，基因編碼的蛋白質一開始在內質網中合成，然后通過不同的方式運輸至細胞內的不同囊泡狀結構，再發揮具體作用[13]。王淋等[14]克隆了杜仲基因，通過瞬時轉化煙草下表皮細胞，觀察重組蛋白在細胞內的具體熒光位置，判斷EuHMGR蛋白質位于內質網中。本課題組構建了pCambia1300-CoHMGR-GFP重組載體，農桿菌介導轉化進煙草細胞內，激光共聚焦顯微鏡觀察到基因編碼蛋白質所發的綠色熒光和內質網標記蛋白ER-HDEL所發的紅色熒光重合，因此初步判斷CoHMGR蛋白位于內質網。

基因受多種外界因素的調控，研究發現溫度、鹽脅迫處理均可以影響人參基因的表達量[15-16]；生物誘導物如大腸桿菌能夠提高火索麻懸浮培養物中基因和基因的表達水平，從而上調薯蕷皂苷元的產量[17]；對鐵皮石斛幼苗施加內生真菌菌液后，鐵皮石斛基因表達量明顯上調[18]。

植物生長調節劑通常用于促進植物的生長發育，但是最近的研究發現部分植物生長調節劑也可以誘導植物體內萜類物質途徑關鍵基因的表達和萜類物質的生成，這可能是提高藥用植物特征活性成分的有效途徑[19]。茉莉酸甲酯和乙烯利都是激活植物防御系統的的重要激素，外源施加這2種激素能夠提高藥用植物的有效成分產量。

銀杏是我國特產的珍貴樹種，據報道，不同的外源激素處理銀杏幼苗，會誘導甲羥戊酸途徑內基因表達和銀杏內酯生成，結果顯示茉莉酸甲酯、乙烯利都顯著提升了銀杏、、的表達量，乙烯利對、基因也有正向誘導作用，這2種激素都顯著提升了處理后葉片中銀杏內酯的含量[20-22]。目前，關于茉莉酸甲酯誘導藥用植物次生代謝產物產生的研究比較廣泛，已經報道的有茉莉酸甲酯誘導靈芝三萜物質的合成[23]，提高羅漢果皂苷及其中間產物含量[24]等，乙烯利在促進藥用植物活性成分生成方面的研究較少。

山茱萸生長周期長，生長年限達到7～10年才能結果，盛產期則需要等20年之久，這給在山茱萸本體中研究關鍵基因造成了不小的困難，因此本課題組選用了山茱萸2年生幼苗作為激素噴施的實驗對象[25]。本研究中，設計了不同濃度的茉莉酸甲酯、乙烯利分別處理山茱萸幼苗葉片，綜合實時熒光定量PCR結果和高效液相色譜結果發現，200 μmol/L茉莉酸甲酯和250 mg/L乙烯利處理都正向調控了基因表達量和山茱萸葉片中莫諾苷、馬錢苷含量，這也在一定程度上說明基因在山茱萸萜類物質合成中起重要作用，對目的基因表達量和莫諾苷、馬錢苷含量的相關性分析結果表明：表達量與莫諾苷含量之間有較強的聯系，和馬錢苷含量的相關性則不大，為后續研究基因功能、解析山茱萸萜類物質合成途徑以及使用外源激素促進山茱萸活性成分生成提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Subcellular localization and expression analysis ofgene from

WANG Yao-yao1, 2, FAN Zhen-jie1, 2, LI Jiong3, LIU Xiao-ran1, 2, WANG Long1, 2, ZHANG Jia-qi1, 2, XU Hua-wei1, 2, HOU Xiao-gai1, 2, HOU Dian-yun1, 2

1. College of Agricultural, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China 2. The Luoyang Engineering Research Center of Breeding and Utilization of Dao-di Herbs, Luoyang 471023, China 3. Chinese Medicinal Materials Production Technology Service Center of Department of Agriculture of Henan Province, Zhengzhou 450000, China

To study the subcellular localization of the protein encoded by thegene of, and the correlation of spraying different concentrations of exogenous hormones on the expression ofgene and the content of active ingredients.Agrobacterium infects tobacco leaves, and the subcellular localization of CoHMGR protein was observed under a confocal inverted laser microscope. Using different concentrations of methyl jasmonate and ethephon to spray two-year-old seedlings of, quantitative real-time PCR (qPCR) was used to determine the expression levels ofgene at different periods after treatment, high performance liquid chromatography (HPLC) was used to detect the content of morroniside and loganin.The CoHMGR protein localization in the endoplasmic reticulum was observed under the laser confocal microscope. The results of qPCR and HPLC showed that 200 μmol/L methyl jasmonate and 250 mg/L ethephon had a positive induction effect on the target gene expression level and active ingredient content.The CoHMGR protein is located in the endoplasmic reticulum. The exogenous spraying of 200 μmol/L methyl jasmonate and 250 mg/L ethephon can significantly increase the expression ofand the content of monoside and loganin, laying a foundation for in-depth analysis of the function ofgene.

Sieb. et Zucc.;; subcellular localization; morroniside; loganin; expression analysis

R286.12

A

0253 - 2670(2022)19 - 6174 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.023

2022-03-06

國家自然科學基金資助項目（U1404829）；中央本級重大增減支項目（2060302）；河南省自然科學基金項目（202300410151）；河南省科技攻關項目（202102110156）；河南省中藥材產業技術體系建設專項資金資助；河南省中藥材產業科技特派員服務團資助

王瑤瑤，碩士研究生，主要從事中藥資源評價與利用方面的研究。E-mail: 18438616133@163.com

侯典云，教授，博士生導師。Tel: (0379)64282340 E-mail: dianyun518@163.com

[責任編輯 時圣明]