基于UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜和分子對接技術篩選藿香正氣水抗新冠病毒潛在質量標志物

張雅莉，韓建勛, 2*，圖爾蓀托合提·托合提薩伊普，孫兆增，宋 薇，張玉松，魏海燕，肖進進

基于UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜和分子對接技術篩選藿香正氣水抗新冠病毒潛在質量標志物

張雅莉1，韓建勛1, 2*，圖爾蓀托合提·托合提薩伊普1，孫兆增1，宋 薇1，張玉松3，魏海燕1，肖進進1

1. 譜尼測試集團股份有限公司，北京 100095 2. 譜尼測試集團北京檢驗認證科學研究院有限公司，北京 100095 3. 北京譜尼醫學檢驗實驗室有限公司，北京 100095

基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜（UPLC-Q-TOF-MS）指紋圖譜和分子對接技術，確定藿香正氣水（Huoxiang Zhengqi Shui，HZS）抗新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的潛在質量標志物（quality markers，Q-Marker）。對27批HZS樣品建立UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜，結合化學計量學方法，篩選出HZS的差異性成分；以瑞德西韋為陽性對照，將HZS的差異性成分與SARS-CoV-2主蛋白酶（main protease，Mpro）進行分子對接，進一步確定HZS的潛在Q-Marker。通過建立27批HZS樣品的UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜，標定了27種共有化合物；結合層次聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA），確定了其中14種共有化合物在27批HZS樣品中具有較大的差異性，并鑒定出了橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內脂、甜橙素、甘草酸、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮、桔皮素、歐前胡素、珊瑚菜素9種差異性化合物；9種差異性化合物的分子對接結果顯示，橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內脂、甘草酸、歐前胡素、珊瑚菜素6種化合物能與SARS-CoV-2 Mpro的活性氨基酸結合，具有抑制SARS-CoV-2 Mpro的潛能，可作為HZS的潛在Q-Marker。將UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜、化學計量學分析和分子對接技術交叉使用，確定了HZS的潛在Q-Marker，該方法為藥物成分鑒定、同一類藥物成分差異性分析，及其功效研究方面提供一定參考。

藿香正氣水；質量標志物；UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜；分子對接；SARS-CoV-2 Mpro潛在抑制劑預測；橙皮苷；氧化前胡素；新比克白芷內脂；甘草酸；歐前胡素；珊瑚菜素

藿香正氣水（Huoxiang Zhengqi Shui，HZS）是由蒼術、陳皮、厚樸（姜制）、白芷、茯苓、大腹皮、生半夏、甘草浸膏、廣藿香油、紫蘇葉油等提取配制而成，具有解表化濕、理氣和中的作用，用于外感風寒、內傷濕滯或夏傷暑濕所致的感冒、胃腸型感冒等癥[1]。自新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）爆發以來，中藥治療發揮了不可或缺的作用，其中藿香正氣系列中成藥是《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》中醫學觀察期表現為乏力伴胃腸不適者的推薦用藥，現已在抗疫一線初顯成效[2-3]。經查證，在國家藥品監督管理局備案的HZS產品共有162條記錄，且不同HZS產品價格也有很大差異，同規格的產品價格差異可達20倍之多。有文獻[4-6]表明，不同廠家的HZS產品質量差異較大。經查詢國家藥品監督管理局官網，近5年，就有87條HZS違規查處記錄，是中成藥中的常見風險監控項目。目前，有些廠家為了降低生產成本，采用質量較差的原材料，或以設備簡陋、索價低廉的小廠代為提取濃縮[7]，這導致了不同廠家HZS的質量差異，從而直接影響了其臨床使用中的藥物有效性。因此，對HZS進行成分鑒別和成分功效評價，在提高其藥物有效性方面具有重大意義。

中藥指紋圖譜是我國廣為接受的中藥質量評價方法，可以直觀地揭示中藥化學特征，從化學信息的角度評價中藥質量，用于篩選能夠真實反映產品內在品質的標志物[8-11]。目前對于HZS指紋圖譜的建立和質量評價研究，主要集中在氣相和液相色譜指紋圖譜，通過標示HZS特征的共有峰圖譜，以評價其均一性和穩定性。例如聶黎行等[12]建立了13個廠家的28批HZS的UPLC指紋圖譜，確定了18個共有峰，并采用層次聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）方法，對指紋圖譜進行了模式識別；李紅梅等[13]建立了10批HZS氣相色譜指紋圖譜，確定了16個共有峰。然而液相色譜和氣相色譜指紋圖譜存在一定的片面性，尚無法實現更為完整全面的質量評價及鑒別目的，且對共有峰的指認較困難。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜（UPLC-Q-TOF-MS）將具有高分離度、高靈敏度的液相色譜系統，與能同時提供母離子和碎片離子準確質量數以及元素組成的高分辨質譜有機結合，通過建立指紋圖譜，可快速分析和表征中藥材復雜成分[14-15]。分子對接技術以結構分子生物學和計算機輔助藥物設計相結合的方式，通過將配體與受體進行對接，評價其對接體系的穩定性，篩選與受體活性部位空間和電性特征相匹配的小分子化合物，具有周期短、操作性強等優勢，已經逐漸成為中藥活性成分篩選的重要手段，廣泛應用于中藥質量標志物（quality markers，Q-Marker）的篩選過程中[16-19]。有研究表明，藿香正氣水中的主要成分包括橙皮苷、甘草酸、歐前胡素、厚樸酚等[5]。其中橙皮苷[20]和甘草酸[21]與新型冠狀病毒SARS-CoV-2主蛋白酶（main protease，Mpro）具有較好的結合親和力，從而對SARS-CoV-2產生一定的抑制作用。因此，為進一步對HZS進行質量評價，明確不同生產廠家HZS的共有物質基礎和潛在Q-Marker，提高其質量控制水平，本研究以25個廠家共計27批HZS作為研究對象，建立了HZS的UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜，標定了其共有峰并進行化合物表征，通過相似度評價結合HCA和PCA等模式識別方法評價不同廠家的HZS差異性；并選用SARS-CoV-2 Mpro為篩選靶標，與HZS的差異性成分進行分子對接獲得抗SARS-CoV-2的潛在活性成分，進一步確定HZS的潛在Q-Marker，為HZS質量評價和有效控制提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設備

Xevo G2-XS型超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜，美國Waters公司，MassLynx 4.1軟件；AB135-S型分析天平（感量0.01 mg）、AB204-S型分析天平（感量0.1 mg），瑞士Mettler Toledo公司；Milli-Q型超純水系統，美國Millipore公司；有機相濾膜（尼龍），0.22 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 材料與試劑

HZS產品在網上藥店進行采購，共收集25個廠家的27個品牌共計27批產品，詳見表1。對照品甘草苷（批號111610-201908）、橙皮苷（批號110721-202019）、厚樸酚（批號110729-202015）均購自中國食品藥品檢定研究院，質量分數均≥98%；對照品甘草酸（批號C0008456）、歐前胡素（批號B0002871）均購自曼哈格檢測技術股份有限公司，質量分數均≥98%。乙醇、乙腈，色譜級，美國Fisher Scientific公司；甲酸，美國Acros公司，質量分數98%；水為自制超純水。

表1 27批HZS樣品信息

Table 1 Information of 27 batches of HZS samples

樣品編號廠家品牌生產批號 S1云南白藥集團股份有限公司云南白藥WTEB2102 S2云南萬裕藥業有限公司葵花210004B S3云南裕豐藥業有限公司萬通200001A S4云南楚雄天利藥業有限公司健之佳20200876 S5云南裕豐藥業有限公司東盛友邦200002D S6云南騰藥制藥股份有限公司騰藥20201221 S7廣東一力羅定制藥有限公司好立康210705 S8廣西靈峰藥業有限公司金雞20042902 S9漳州片仔癀藥業股份有限公司片仔癀2006038 S10四川彩虹制藥有限公司康森210504 S11四川天府康達藥業集團有限公司府慶210704 S12四川泰華堂制藥有限公司泰華堂210516 S13四川依科制藥有限公司蜀中210612 S14四川省通園制藥集團有限公司育林200510 S15四川泰華堂制藥有限公司正遠210607 S16四川德元藥業集團有限公司德輝210415 S17四川禾邦旭東制藥有限公司禾邦200502 S18太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司太極2021022 S19湖南時代陽光藥業股份有限公司永州20210302 S20湖南漢森制藥股份有限公司漢森2004101 S21湖北東信藥業有限公司東信210201 S22武漢太福制藥有限公司太福210506 S23天津和治藥業集團有限公司美舒通210201 S24天津中新藥業集團股份有限公司隆順榕060084 S25北京同仁堂科技發展股份有限公司同仁堂20140162 S26吉林省撫松制藥股份有限公司林海191004 S27吉林隆泰制藥股份有限公司明復20200614

2 方法

2.1 供試品溶液制備

取HZS樣品1.0 mL于10 mL量瓶中，加入50%乙醇溶液定容至刻度，渦旋混勻，取適量過0.22 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Acquity UPLC?HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫45 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣量5 μL；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈；平衡時間15 min；梯度洗脫：0～7 min，10%～20%乙腈；7～30 min，20%～50%乙腈；30～35 min，50%～90%乙腈；35～37 min，90%乙腈；37～37.1 min，90%～10%乙腈；37.1～40 min，10%乙腈；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度550 ℃；脫溶劑氣體積流量600 L/h；錐孔氣體積流量50 L/h；毛細管電壓2 kV；錐孔電壓40 eV；離子源：ESI+；工作模式：MSE模式；掃描模式：靈敏度模式；掃描范圍50～1000；掃描時間1.0 s；碰撞能量：低碰撞能量為off，高碰撞能量為20～40 eV。

2.3 指紋圖譜建立

將27批HZS樣品按“2.1”項方法處理后按照“2.2”項方法進行UPLC-Q-TOF-MS分析，生成基峰離子流（base peak chromatogram，BPI）譜圖，導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，建立指紋圖譜，并進行相似度分析。

2.4 共有峰鑒定

將UPLC-Q-TOF-MS采集的HZS樣品數據，導入到UNIFI 1.9.4軟件中完成質量校正、加和離子設定等處理，進行化合物峰提取，并結合UNIFI 1.9.4軟件自帶的中藥數據庫以及Chemical Book等線上數據庫進行化合物匹配鑒定。UNIFI 1.9.4軟件參數設置：高能量下響應閾值為20，低能量下響應閾值為200；精確質量偏差閾值為0.005；可識別的化合物加和峰形式包括＋H、＋H2O＋H、?e峰。

2.5 數據分析

將UPLC-Q-TOF-MS采集的HZS樣品相關數據，分別導入到IBM SPSS Statistics 21.0軟件以及EZInfo 3.0軟件進行HCA和差異顯著性檢驗以及PCA，分析不同HZS樣品的差異性。

2.6 分子對接

將“3.4”項中得到的差異性成分與SARS-CoV-2 Mpro進行分子對接篩選出抗SARS-CoV-2的潛在活性成分，進一步確定HZS的潛在Q-Marker。SARS-CoV-2 Mpro蛋白（PDB ID：7AF0）的晶體結構從RSCB PDB數據庫（https://www.rcsb.org/）中獲取。運用PyMOL（version 2.3.1）（https://pymol. org/）可視化軟件移除配體和水分子，用AutoDock（ADT，version 1.5.6）軟件加氫、加電荷（compute gastieger），建立剛性盒子，盒子的三維坐標參數如表2所示。篩選出的HZS差異性成分3D結構的SDF格式文件從PubChem數據庫（https://pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取，用PyMOL可視化軟件獲得pdb格式文件，用AutoDock激活其可旋轉的氫原子，并且以pdbqt文件的形式保存。前期工作準備好之后，打開Command Prompt命令提示符窗口進行Vina對接。得到的對接結構通過PyMOL軟件可視化，通過Ligplot軟件（https://www.ebi.ac.uk/ thornton-srv/software/LigPlus/）和蛋白質-配體相互作用分析工具（https://plip.biotec.tu-dresden.de/plip- web/plip/index）分析HZS差異性成分與SARS-CoV- 2 Mpro之間形成的氫鍵、疏水鍵等作用力。

表2 剛性盒子的三維坐標參數

Table 2 3D coordinate parameters of rigid box

設置參數數值/nm 盒子的中心坐標值x1.224 0 y?1.325 1 z0.514 5 盒子三維坐標值x4.0 y6.8 z6.8

3 結果與分析

3.1 指紋圖譜建立

將27批HZS樣品的BPI譜圖以cdf格式導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”進行分析，以S1樣品譜圖為參照圖譜，設定時間窗寬度為0.1 min，進行多點校正后自動峰匹配，其指紋圖譜疊加見圖1，共確定27個共有峰，以中位數法生成對照指紋圖譜（圖R）。將各樣品與R進行比較，得到S1～S27的相似度分別為0.910、0.922、0.972、0.819、0.984、0.982、0.975、0.909、0.927、0.976、0.937、0.790、0.914、0.935、0.837、0.816、0.950、0.973、0.947、0.941、0.900、0.963、0.947、0.966、0.931、0.899、0.855，各樣品的相似度分布在0.790～0.984，表明27批HZS樣品質量存在一定的差異性。

圖1 27批HZS指紋圖譜疊加

3.2 主要共有峰鑒定

使用UNIFI軟件對27批HZS樣品的MSE原始數據進行處理。進行峰識別和對齊后，得到包含母離子質荷比、保留時間RT和離子響應強度的數據矩陣，結合UNIFI軟件自帶的中藥數據庫及Chemical Book等線上數據庫對“3.1”項中確定的27個共有峰進行鑒定，推斷出14種化合物（表3），其中5種化合物經過對照品進行比對驗證，1（檳榔次堿）號峰來源于大腹皮，6（甘草苷）、8（新甘草苷）、18（甘草酸）號峰來源于甘草，9（橙皮苷）、15（甜橙素）、19（川陳皮素）、20（3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮，3,5,6,7,8,3′,4′-heptamethoxyflavone，HMOF）、21（桔皮素）號峰來源于陳皮，13（氧化前胡素）、14（新比克白芷內脂）、22（歐前胡素）、23（珊瑚菜素）號峰來源于白芷，24（厚樸酚）號峰來源于厚樸。

表3 27批HZS主要共有峰的鑒定

Table 3 Identification of mainly common peaks of 27 batches of HZS samples

峰號tR/min化合物分子式準分子離子(m/z)δ/(×10?6)加和離子來源藥材 10.85檳榔次堿C7H11NO2160.096 1?5.0＋H2O＋H，＋H大腹皮[22-23] 66.35甘草苷*C21H22O9419.133 4?0.7＋H甘草[24] 87.76新甘草苷C21H22O9419.133 2?1.2＋H甘草[25-26] 98.94橙皮苷*C28H34O15611.197 71.0＋H陳皮[27-29] 1312.50氧化前胡素C16H14O5305.101 8?0.6＋H2O＋H白芷[30-31] 1413.30新比克白芷內脂C17H16O6317.102 00.0＋H，＋H2O＋H白芷[31] 1518.40甜橙素C20H20O7373.127 8?1.1＋H陳皮[29,32] 1821.64甘草酸*C42H62O16823.411 30.4＋H甘草[33-34] 1922.94川陳皮素C21H22O8403.138 5?0.5＋H陳皮[28-29] 2024.60HMOFC22H24O9433.149 2?0.2＋H，?e陳皮[29] 2125.32桔皮素C20H20O7373.128 30.3＋H陳皮[28] 2227.10歐前胡素*C16H14O4271.096 50.0＋H白芷[31] 2328.88珊瑚菜素C17H16O5301.107 00.0＋H白芷[35] 2431.69厚樸酚*C18H18O2267.137 5?1.5＋H厚樸[36]

*為經對照品驗證

*compound comfirmed by reference substance

3.3 HCA

將“3.1”項中得到的27個共有峰的峰面積數據導入IBM SPSS Statistics 21.0軟件中，運用ward法，以平方歐氏（Euclidean）距離為測度，進行HCA，結果如圖2所示。當平方Euclidean距離為5時，各樣品聚類效果最好，27批HZS樣品可分為3類，S7、S11～S13、S15～S17、S21～S23、S25、S27聚為一類，S3、S5、S6、S8～S10、S14、S18～S20、S24、S26聚為一類，S1、S2和S4聚為一類。

3.4 PCA

應用EZInfo 3.0軟件對正離子模式下各HZS樣品的UPLC-Q-TOF-MS原始數據進行PCA，圖3為其PCA得分圖。結果顯示，各HZS樣品分為3類，S7、S10～S13、S15～S17、S21、S22、S27為一類，S6、S8、S9、S14、S18～S20、S23～S26為一類，S1～S5為一類。除S3、S5、S10、S23、S25樣品外，其他樣品的PCA結果與“3.3”項HCA結果一致。

圖2 27批HZS樣品的HCA

圖3 27批HZS樣品的PCA得分圖

通過載荷散點圖進一步對影響HZS質量的化學成分進行比較和分析。在載荷散點圖中的各個點表示各個質荷比-保留時間變量，根據變量離原點的距離判定變量對主成分的權重影響，離原點越遠則表明該變量對主成分的影響權重越大[37]。圖4為各HZS樣品27個共有峰的PCA載荷散點圖，可以看出9（橙皮苷）、18（甘草酸）、20（HMOF）、21（桔皮素）、26號峰對主成分1的貢獻率較大，10、13（氧化前胡素）、14（新比克白芷內脂）、15（甜橙素）、16、17、22（歐前胡素）、23（珊瑚菜素）、25號峰對主成分2的貢獻較大，說明以上14種化合物在27批HZS樣品中的相對含量存在較大差異，是HZS的差異性成分。

3.5 潛在Q-Marker的確定

以藥物瑞德西韋為陽性對照，以HZS 9種已鑒定出的差異性成分橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內脂、甜橙素、甘草酸、HMOF、桔皮素、歐前胡素、珊瑚菜素作為研究對象，分別與SARS-CoV-2 Mpro進行對接，以結合能大小、結合位點等作為評價指標，篩選出對SARS-CoV-2 Mpro可能有抑制作用的HZS潛在活性成分，作為HZS的潛在Q-Marker。陽性對照和9種差異性成分與SARS-CoV-2 Mpro的對接結果如表4所示。由表4可知，瑞德西韋與SARS-CoV-2 Mpro的結合能為?28.88 kJ/mol，差異性成分中橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內脂、甜橙素、甘草酸、HMOF、桔皮素、歐前胡素、珊瑚菜素與SARS-CoV-2 Mpro的結合能分別為?36.84、?26.37、?28.46、?26.37、?38.09、?25.53、?26.37、?28.04、?28.46 kJ/mol，可見這9種差異性成分與SARS-CoV-2 Mpro結合能接近于陽性對照與SARS-CoV-2 Mpro的結合能。有文獻顯示，復合物的穩定性主要由配體和受體之間形成的氫鍵和疏水鍵等作用力大小決定，形成的作用力越多，配體與受體結合的穩定性越高[38-39]。由表4可知，瑞德西韋與SARS-CoV-2 Mpro結合，形成2個氫鍵和13個疏水鍵，橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內脂、甜橙素、甘草酸、HMOF、桔皮素、歐前胡素、珊瑚菜素與SARS-CoV-2 Mpro結合分別形成了9、2、3、3、8、3、3、1、1個氫鍵和9、8、7、7、8、6、6、8、7個疏水鍵，這可能是這9種化合物與SARS-CoV-2 Mpro的結合能小于或者較為接近瑞德西韋的原因。

圖4 27批HZS樣品的PCA載荷散點圖

表4 HZS的差異性成分與SARS-CoV-2 Mpro的結合能、氫鍵和疏水鍵信息

Table 4 Binding affinity, interactions with SARS-CoV-2 Mpro and binding sites of differential compounds in HZS

化合物名稱結合能/(kJ?mol?1)氫鍵疏水鍵 數量結合位點數量結合位點 橙皮苷?36.849Thr24, Cys44, His41, Glu166, Cys145, Thr269Thr45, Met49, Ser46, Gln189, His163, Ser144, Leu141, Gly143, Thr25 氧化前胡素?26.372Glu166, Cys1458Met165, Met49, Thr25, Leu27, Gly143, Asn142, His164, His163 新比克白芷內脂?28.463Arg298, Thr111, Thr2927Phe294, Asn151, Asp295, Gln110, Ile106, Ser158, Asp153 甜橙素?26.373Lys137, Leu287, Arg1317Asp289, Leu286, Leu271, Leu272, Tyr239, Tyr237, Thr199 甘草酸?38.098Ser158, Arg298, Asp295, Asn151, Thr111, Gln1108Asp245, Gln107, Val104, Asp153, Phe8, Phe294, Ile249, His246 HMOF?25.533Lys137, Thr199, Ser2846Asp197, Arg131, Leu287, Asp289, Glu288, Leu286 桔皮素?26.373Thr199, Leu287, Lys1376Asp289, Tyr237, Tyr239, Leu272, Leu271, Leu286 歐前胡素?28.041Ser1588 Phe294, Asp295, Asp153, Val104, Ile106, Gln110, Asn151, Thr111 珊瑚菜素?28.461Ser1587Phe294, Gln110, Ile106, Asp153, Lys102, Ile152, Asn151 瑞德西韋?28.882Thr24, Phe14013Thr26, His41, Thr25, Gly143, Cys145, His163, Leu141, Glu166,Met165, Gln189, Ser46, Met49, Asn142

有些氨基酸殘基形成2個氫鍵，因此氫鍵數量≥氨基酸殘基數量

some amino acid residues form two hydrogen bonds, so the number of hydrogen bonds ≥ the number of amino acid residues

據文獻報道[40]，SARS-CoV-2 Mpro具有S1（Phe140、Leu141、His163、Met165、Glu166、His172）、S2（Met49、Asp187、Gln189）、S1’（Thr25、Leu27、Cys38、Pro39、Val42、Cys145）、S2’（Thr26、Asn28、Tyr118、Asn119、Gly143）和S4（Leu167、Gln192）5個活性口袋，配體通常需要與靶蛋白的關鍵活性氨基酸殘基結合，才能有效抑制其活性[41]。從結合位點角度分析，瑞德西韋位于SARS-CoV-2 Mpro活性口袋S1、S2、S1’、S2’和S4中（圖5），且與S1的活性氨基酸殘基Phe140結合形成1個氫鍵，與S1、S2、S1’、S2’的活性氨基酸殘基Thr26、Thr25、Gly143、Cys145、His163、Leu141、Glu166、Met165、Gln189、Met49結合形成10個疏水鍵（表4和圖6- A）。而9種差異性成分中橙皮苷和氧化前胡素也位于活性口袋S1、S2、S1’、S2’和S4中（圖5），橙皮苷與S1、S1’、S2’的活性氨基酸殘基Glu166、Cys145、Thr26結合形成4個氫鍵，與S1、S2、S1’、S2’的活性氨基酸殘基Met49、Gln189、His163、Leu141、Gly143、Thr25結合形成6個疏水鍵（表4和圖6-B）；氧化前胡素與S1、S1’的活性氨基酸殘基Glu166、Cys145結合形成2個氫鍵，與S1、S2、S1’、S2’活性氨基酸殘基Met165、Met49、Thr25、Leu27、Gly143、His163結合形成6個疏水鍵（表4和圖6-C）。

圖5 SARS-CoV-2 Mpro活性口袋S1、S2、S1’、S2’和S4與配體瑞德西韋、橙皮苷和氧化前胡素對接的3D示意圖

圖6 瑞德西韋(A)、橙皮苷(B)、氧化前胡素(C)、新比克白芷內脂(D)、甘草酸(E)、歐前胡素(F)、珊瑚菜素(G)與SARS-CoV-2 Mpro的分子對接2D圖

此外，還有文獻報道[42-43]，Thr24、His41、Cys44、Thr45、Ser46、Asn142、Ser144、His164、Pro168、Arg188、Thr190、Thr111、Thr292、Phe294、Gln110、Asp153、Gln107、Ile249、His246等也是SARS-CoV-2 Mpro的活性氨基酸殘基，可形成SARS-CoV-2 Mpro的活性口袋S5（圖7）。瑞德西韋、橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內脂、甘草酸、歐前胡素、珊瑚菜素落在S5口袋中，且與活性氨基酸殘基結合（圖7）。其中，瑞德西韋與S5的活性氨基酸殘基Thr24結合形成1個氫鍵，與活性氨基酸殘基His41、Ser46、Asn142結合形成3個疏水鍵（表4和圖6-A）；橙皮苷與S5的活性氨基酸殘基Thr24、Cys44、His41結合形成5個氫鍵，與活性氨基酸殘基Thr45、Ser46、Ser144結合形成3個疏水鍵（表4和圖6-B）；氧化前胡素與S5的活性氨基酸殘基Asn142、His164結合形成2個疏水鍵（表4和圖6-C）；新比克白芷內脂與S5的活性氨基酸殘基Thr111、Thr292結合形成2個氫鍵，與活性氨基酸殘基Phe294、Gln110、Asp153結合形成3個疏水鍵（表4和圖6-D）；甘草酸與S5的活性氨基酸殘基Thr111、Gln110結合形成2個氫鍵，與活性氨基酸殘基Gln107、Asp153、Phe294、Ile249、His246結合形成5個疏水鍵（表4和圖6-E）；歐前胡素與S5的活性氨基酸殘基Phe294、Asp153、Gln110、Thr111結合形成4個疏水鍵；珊瑚菜素與S5的活性氨基酸殘基Phe294、Gln110、Asp153結合形成3個疏水鍵（表4和圖6-F）。

圖7 SARS-CoV-2 Mpro活性口袋S5和配體瑞德西韋、橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內脂、甘草酸、歐前胡素和珊瑚菜素對接的3D示意圖

綜上，9種差異性化合物中，只有橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內脂、甘草酸、歐前胡素、珊瑚菜素與SARS-CoV-2 Mpro的關鍵活性氨基酸殘基結合。因此，橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內脂、甘草酸、歐前胡素、珊瑚菜素可能對SARS- CoV-2 Mpro具有一定的潛在抑制作用，可作為HZS的潛在Q-Marker，以對HZS進行質量評價。

3.6 質量評價

以“3.5”項中確定的6種潛在Q-Marker橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內脂、甘草酸、歐前胡素、珊瑚菜素在HZS中的峰面積作為指標，評價不同HZS樣品的質量。將各HZS樣品中6種潛在Q-Marker化合物的峰面積數據導入IBM SPSS Statistics 21.0軟件中，進行差異顯著性檢驗，組間均數比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差（LSD）檢驗，結果如表5所示。從表5中可以看出，27批HZS樣品中6種潛在Q-Marker的峰面積均存在顯著性差異（＜0.01）。其中，橙皮苷峰面積較高的樣品有S1～S4、S10、S11；氧化前胡素峰面積較高的樣品有S2、S6、S9、S23～S25；新比克白芷內脂峰面積較高的樣品有S6、S9、S25；甘草酸峰面積較高的樣品有S3、S8～S10、S12～S15、S19；歐前胡素峰面積較高的樣品有S2、S3、S5、S6、S9、S18、S21、S23～S25；珊瑚菜素峰面積較高的樣品有S2、S3、S6、S9、S18、S19、S25、S26。

綜合6種潛在Q-Marker峰面積比較結果，27批HZS樣品中，樣品S2、S3、S6、S9、S25具有較好的抗SARS-CoV-2的潛在活性。

4 討論

通過建立不同HZS樣品的UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜，標定了27種共有化合物，相似度在0.790～0.984，說明不同HZS樣品具有一定的差異性；通過化學計量學分析，確定了其中14種共有化合物為差異性化合物，共鑒定出了橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內脂、甜橙素、甘草酸、HMOF、桔皮素、歐前胡素、珊瑚菜素9種差異性化合物。這些差異性化合物主要來源于陳皮、白芷、甘草藥材，因此不同HZS樣品的差異性可能是以上3種藥材原材料質量、投料以及工藝參數存在差異性導致的。唐素芳[4]采用UPLC-Q-TOF組學以及指紋圖譜等研究方法，對抽取的22個生產廠家、68批次藿香正氣水的質量進行了評價研究，結果發現個別企業陳皮和白芷的特征峰缺失嚴重，處方中甘草浸膏投料普遍不足，存在提取物投料或替代投料嫌疑，這與本研究結論基本一致。

表5 27批HZS樣品中橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內脂、甘草酸、歐前胡素、珊瑚菜素的峰面積比較 (, n = 3)

Table 5 Peak area of hesperidin, oxypeucedanin, neobyakangelicol, glycyrrhizic acid, imperatorin and phellopterin of 27 batches of HZS samples (, n = 3)

樣品編號峰面積/(×106) 橙皮苷氧化前胡素新比克白芷內脂甘草酸歐前胡素珊瑚菜素 S16.02±0.33a1.81±0.02m0.88±0.01m1.50±0.11n1.41±0.03e2.53±0.07fg S25.49±0.09bc4.16±0.09cd2.08±0.08d4.72±0.42hi1.99±0.08b3.25±0.15b S35.82±0.05a4.11±0.03d1.98±0.03e6.14±0.01cd2.09±0.04b3.14±0.04bc S45.59±0.09b0.77±0.02p0.45±0.02p1.82±0.03mn0.64±0.02hi1.07±0.05lm S54.95±0.05e3.92±0.04e1.77±0.03fg5.31±0.18fg1.91±0.07bc2.86±0.09d S63.94±0.05j4.19±0.06cd2.29±0.05c5.79±0.15de2.39±0.06a3.90±0.08a S75.22±0.01d4.10±0.03d1.71±0.02g3.33±0.12kl1.67±0.03d2.35±0.04hi S84.03±0.14j2.12±0.04l0.99±0.03kl6.16±0.06cd0.88±0.05g1.72±0.08jk S94.61±0.06fg5.97±0.13a3.83±0.11a6.73±0.37b2.39±0.31a3.89±0.16a S105.45±0.04bc2.38±0.01k0.75±0.01n6.12±0.31cd1.45±0.07e2.24±0.10i S115.30±0.07cd1.35±0.01o0.47±0.01p5.49±0.30ef1.06±0.02f1.57±0.01k S124.67±0.03fg1.94±0.02m0.59±0.00o7.16±0.09a1.20±0.02f1.75±0.02j S134.14±0.04ij3.69±0.06f1.61±0.04h7.27±0.17a1.65±0.05d2.53±0.04fg S144.72±0.05f2.51±0.07jk1.32±0.06i6.24±0.07c0.85±0.01g1.16±0.02l S154.33±0.11hi1.25±0.05o0.44±0.02p6.76±0.07b0.57±0.01i0.99±0.02m S164.33±0.04hi2.42±0.05k0.92±0.02lm5.06±0.09gh1.16±0.02f1.61±0.03jk S173.53±0.09k2.43±0.05jk1.01±0.02kl3.11±0.18l0.35±0.01j0.69±0.01n S182.72±0.09o2.56±0.13ij1.04±0.04k5.71±0.07ef1.76±0.05cd3.08±0.11bc S192.78±0.06no2.68±0.02hi1.19±0.02j6.24±0.28c1.68±0.04d3.02±0.06c S202.96±0.06mn3.83±0.03e1.85±0.02f4.12±0.10j1.41±0.06e2.39±0.05gh S214.47±0.02gh3.42±0.01g1.56±0.01h4.89±0.17h1.93±0.08bc2.74±0.04de S224.00±0.12j1.64±0.04n0.68±0.02n2.08±0.13m0.77±0.03gh1.07±0.04lm S232.72±0.01o4.28±0.05c1.74±0.01g3.47±0.04kl1.81±0.04cd2.70±0.09de S242.05±0.10p4.26±0.11c2.01±0.09de4.18±0.05j1.79±0.04cd2.58±0.05ef S253.07±0.12lm5.10±0.06b2.68±0.06b3.65±0.10k2.03±0.04b3.13±0.07bc S261.86±0.01p2.75±0.02h1.30±0.01i4.32±0.06j1.71±0.05d3.01±0.01c S273.20±0.03l0.43±0.01q0.26±0.00q4.38±0.09ij0.50±0.00ij0.79±0.01n

表中同列不同小寫字母表示27批HZS樣品中化合物峰面積存在顯著差異（＜0.01）

different lowercase letters in the same column in the table indicate that there are significant differences in peak areas of compounds in 27 batches of HZS samples (< 0.01)

通過分子對接確定了橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內脂、甘草酸、歐前胡素、珊瑚菜素6種差異性化合物對SARS-CoV-2 Mpro有潛在抑制作用，可作為HZS的潛在Q-Marker。其中，已有研究結果顯示，橙皮苷[44-46]、甘草酸[46-49]以及歐前胡素[50-51]對SARS-CoV-2有一定的抑制作用，而氧化前胡素、新比克白芷內脂和珊瑚菜素尚未有文獻報道，這為SARS-CoV-2小分子抑制劑的研究提供了新思路。《中國藥典》2020年版[1]規定HZS處方中需檢測厚樸和陳皮2項原材料含量，二者分別以厚樸酚、和厚樸酚總量以及橙皮苷含量作為評價標準，建議增加處方中白芷和甘草原材料的檢測方法，以得到更加綜合完整的藿香正氣水質量評價體系。

另外，后續研究仍需通過體外實驗等進行驗證，以進一步確定本研究預測結果的準確性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Screening potential Q-Marker from Huoxiang Zhengqi Shui based on UPLC-Q-TOF-MS fingerprints and molecular docking

ZHANG Ya-li1, HAN Jian-xun1, 2, TUERSUNTUOHETI·Tuohetisayipu1, SUN Zhao-zeng1, SONG Wei1, ZHANG Yu-song3, WEI Hai-yan1, XIAO Jin-jin1

1. Pony Testing International Group Co., Ltd., Beijing 100095, China 2. Pony Testing International Group Beijing Academy of Inspection and Certification Co., Ltd., Beijing 100095, China 3. Beijing Pony Medical Laboratory Co., Ltd., Beijing 100095, China

To screen the potential quality markers (Q-Marker) of anti-coronavirus of Huoxiang Zhengqi Shui (藿香正氣水, HZS) based on the ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) fingerprints and molecular docking.UPLC-Q-TOF-MS fingerprints and chemometric methods were employed to establish fingerprints and find out the difference between the peaks for the 27 batches of HZS samples. The SARS-CoV-2 main protease (Mpro) inhibition potential of the differential compounds among the 27 batches of HZS were further predicted by molecular docking with remdesiviras positive control.The UPLC-Q-TOF-MS fingerprints of 27 batches of HZS samples were set up with 27 common peaks. Combined with hierarchical clustering analysis (HCA) and principal component analysis (PCA), 14 common peaks were determined as differential compounds, and nine of them were identified as hesperidin, oxypeucedanin, neobyakangelicol, sinensetin, glycyrrhizic acid, 3,5,6,7,8,3′,4′-heptamethoxyflavone, tangeretin, imperatorin and phellopterin. Molecular docking results showed that a total of six differential compounds were proven to have a certain inhibitory effect on SARS-CoV-2 Mpro, which can be used as potential Q-Marker of HZS, including hesperidin, oxypeucedanin, neobyakangelicol, glycyrrhizic acid, imperatorin and phellopterin.The potential Q-Marker of HZS was determined by UPLC-Q-TOF-MS fingerprints, chemometric analysis and molecular docking. This method may provide a certain reference for the identification of various drug components, analysis of the differences of the same type drug components and pharmaceutical activity evaluation.

Huoxiang Zhengqi Shui; Q-Marker; UPLC-Q-TOF-MS fingerprint; molecular docking; SARS-CoV-2 Mpro potential inhibitor prediction; hesperidin; oxypeucedanin; neobyakangelicol; glycyrrhizic acid; imperatorin; phellopterin

R283.6

A

0253 - 2670(2022)19 - 6023 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.009

2022-04-12

北京市“科技助力經濟2020”重點專項（SQ2020YFF0414333）；2020年蘇州市新型冠狀病毒感染應急防治專項（XG56）

張雅莉，碩士，中級工程師，研究方向為藥品分析與檢測。E-mail: yfh@ponytest.com

韓建勛，博士，副研究員，研究方向為藥品質量與安全控制。E-mail: yfb@ponytest.com

[責任編輯 鄭禮勝]