飲用水中銅綠假單胞菌定量檢驗盲樣考核結果與分析

張 華，姜 慶，李 杰，吳 迪，張 新

（臨沂市檢驗檢測中心，山東臨沂 276000）

銅綠假單胞菌屬于假單胞菌屬，為需氧、無芽孢、有運動能力以及乳糖非發酵革蘭染色陰性桿菌，是一種常見的條件致病菌，常見于各種感染性疾病，如尿路感染、呼吸系統感染、軟組織感染和各種全身感染，尤其是在燒傷患者和免疫缺陷患者中[1-2]。銅綠假單胞菌在自然界分布廣泛，能夠適應不同環境，且代謝多樣，涵蓋范圍廣泛，包括土壤、水（熱水浴缸、水槽、水龍頭、呼吸機和消毒水）、植物及動物、空氣及其他富含水的場所（游泳池）[3-5]。

飲用水微生物污染是一個常見問題，對公眾健康有著嚴重的影響。銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌，常在飲用水中檢測到。此外，人們越來越重視桶裝飲用水和礦泉水的銅綠假單胞菌污染情況。近些年來，國內外對桶裝水或瓶裝水中檢測出銅綠假單胞菌的情況報道日益增多，桶裝飲用水中銅綠假單胞菌不合格率大于10%[6-7]。

我國最新飲用水標準《食品安全國家標準 包裝飲水》（GB 19298—2014）中微生物限量規定，按照二級采樣方案，同一批次的5份水樣品要求每份水樣品里不得檢出銅綠假單胞菌。如果檢出，則判定為不合格[8]。因此，銅綠假單胞菌檢測在食品安全檢驗中具有重要意義。盲樣考核是為了保證各級食品安全承檢機構檢測結果準確可靠，提高檢驗檢測水平，并以監督和考核為目的的測評活動。臨沂市檢驗檢測中心參加了2022年由山東省市場監督管理局組織的盲樣考核活動，檢驗項目為“飲用水中銅綠假單胞菌定量檢驗”，結果為滿意。為提高實驗室工作質量，總結經驗，本文對實驗過程及結果進行分析。

1 材料與方法

1.1 樣品

收到編號為TL048的銅綠假單胞菌質控樣凍干粉1瓶，在棕色西林瓶內有白色粉末狀樣品，避光儲存于-20 ℃；樣品中的菌含量為0～1.0×106CFU/250 mL；實驗標準菌株：陽性對照菌株為銅綠假單胞菌標準菌株（CICC21636），陰性對照菌株為熒光假單胞菌標準菌株（CICC21620），從中國工業微生物菌種保藏管理中心采購。

1.2 培養基

假單胞菌瓊脂基礎培養基（CN平板）、營養瓊脂（NA）、乙酰胺肉湯和綠膿菌素測定培養基，以上培養基都在保質期內，從北京陸橋股份有限公司采購；VITEK2 GN卡，法國生物梅里埃公司。

1.3 儀器設備

VITEK2 compact全自動微生物分析系統，法國生物梅里埃公司；AC2-4S1生物安全柜，新加坡ESCO；ZGP-2270隔水式恒溫培養箱，上海智誠公司；ZF-2型三用紫外儀，上海安亭電子儀器廠；MLS3780高壓蒸汽滅菌器，日本三洋公司；HTY-2000B集菌儀，杭州泰林生物技術設備有限公司；0.45 μm薄膜過濾器，北京牛牛基因技術有限公司；微量移液槍，Gilson公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品溶解

按照作業指導書，取出盲樣考核樣品并在室溫下放置5 min，在生物安全柜內將銅綠假單胞菌質控品的瓶子打開，樣品開啟后加入5 mL滅菌去離子水溶解混勻，然后轉移至裝有980 mL滅菌去離子水的三角瓶中。隨后，樣品瓶中再加入5 mL滅菌去離子水進行潤洗，潤洗液轉移至該三角瓶，潤洗步驟重復3次。最終可得到1 L原液。

1.4.2 樣品稀釋

250 mL原液用于直接檢測，剩余原液用于10倍系列稀釋后檢測。10倍系列稀釋方法是取100 mL原液加入900 mL滅菌去離子水，混勻得到稀釋10倍的樣品稀釋液，以此方法稀釋到10-4。

1.4.3 樣品過濾

樣品在100級的潔凈工作臺進行過濾操作。首先將0.45 μm孔徑的薄膜過濾器固定在集菌儀上，然后開始抽吸水樣，等濾膜濕潤后，將薄膜過濾器通氣孔關閉，開始過濾。薄膜過濾器內水樣完全過濾后，使用無菌鑷子小心地從濾膜邊緣將過濾后的濾膜夾起，平鋪到CN瓊脂平板上，集菌的濾膜面朝上。

1.4.4 培養

把CN平板倒置，放置于培養箱內，（36±1） ℃培養24～48 h。在培養過程中勤于觀察，可分別在20～24 h和40～48 h觀察濾膜上菌落的生長情況及計數。同時做陽性和陰性對照[9]。

2 結果與分析

2.1 CN平板觀察與計數

按照盲樣作業指導書和《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）操作，從原液至10-4稀釋度進行取樣檢測，TL048樣品在原液、10-1、10-2稀釋度的平板中只生長出一種特征的典型菌落，為綠色菌落，沒有其他可疑菌落生長，結果見表1。

表1 CN平板上計數結果表

2.2 確證性實驗

TL048考核樣品在稀釋10倍的CN平板上只生長綠色菌落。在暗室中，將紫外儀波長365 nm的開關打開，紫外燈照CN平板，發現綠色菌落產熒光，注意不可長時間紫外燈照射，以免影響菌落生長。將綠色菌落轉接到綠膿菌素斜面培養基上，進行綠膿菌素抽提實驗，結果顯示綠膿菌素實驗結果為陽性，則判定該綠色菌落是銅綠假單胞菌。同時，使用VITEK2進行生化鑒定，鑒定結果顯示99%為銅綠假單胞菌。最終菌落計數為2.6×102CFU/250 mL，見表2。

表2 鑒定結果表

3 結論與討論

本次盲樣考核樣品，飲用水中銅綠假單胞菌定量檢驗在CN平板計數報告結果為2.6×102CFU/250 mL，Z值小于2，評價結果滿意。由此可見該實驗室具備銅綠假單胞菌定量檢測的能力。

自2019年以來，《國家食品安全監督抽檢實施細則》將銅綠假單胞菌指標作為包裝飲用水的重點監測項目之一。目前《食品安全國家 包裝飲用水》（GB 19298—2014）標準要求的銅綠假單胞菌檢驗項目為定量檢驗，按照二級采樣方案，每批次5份水樣品，每份水樣都不得檢出（0 CFU/250 mL），如檢出，則判定為不合格，由此看出，銅綠假單胞菌的定量檢測是實驗室進行質量控制的一項重要項目。所以，在進行盲樣考核等實驗過程中，以下問題應該引起人們的注意。①實驗前認真閱讀作業指導書，作業指導書對本次盲樣考核的樣品、實驗方法、結果記錄等有特別要求。例如，本次盲樣考核要求樣品每個稀釋度做2個平行，按照作業指導書進行梯度稀釋，而《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水》（GB 8538—2018）檢驗方法中未有明確要求。②實驗前做好準備工作，包括儀器設備的校準、試運行以及培養基試劑是否齊全。有條件的實驗室可以購買質控樣品進行預實驗，提前發現問題并進行解決。③定量檢測項目一般在作業指導書中表明樣品含量水平，可多做幾個稀釋度，確保結果準確。④保持CN平板表面干燥，防止菌落蔓延生長，將過濾膜貼在平板上時要保持平整，不能留有空隙，避免后續影響銅綠假單胞菌計數。⑤銅綠假單胞菌在生化鑒定時，由于國標方法檢測耗時較長，可借助VITEK2鑒定儀輔助鑒定，進而提高鑒定效率。⑥銅綠假單胞菌在培養48 h后，菌落生長較大，容易連成片，不易觀察計數。因此，可在培養20～24 h和40～48 h后分別觀察濾膜上菌落的生長情況。⑦按照作業指導書進行樣品梯度稀釋時，若樣品總體積為1 L，則應選取2 L的三角瓶或無菌均質袋，確保水樣能夠徹底混合均勻。⑧銅綠假單胞菌為條件致病菌，實驗所用的量筒、三角瓶和薄膜過濾器等應121 ℃高壓滅菌30 min以上，按照規定處理，防止污染環境。