不同培養基和取樣方式對涇陽茯磚茶中冠突散囊菌計數的影響研究

秦 婧，舒 靜，劉 靜，石 菲，孟怡璠

（1.陜西省產品質量監督檢驗研究院，陜西西安 710048；2.漢中市食品藥品監督檢驗檢測中心，陜西漢中 723000）

產自陜西涇陽的茯磚茶歷史悠久，自明朝洪武年間至今已有600多年歷史。如今涇陽茯磚茶已經成為陜西省地理標志產品，成為陜西省對外的一張文化名片。茯磚茶屬于黑茶的一類，為后發酵茶，涇陽茯磚茶與其他種類的后發酵茶相比，其特殊之處在于“發花”這一加工工藝過程給茯磚茶帶來的自然益生菌體“金花”，學名為冠突散囊菌[1]。冠突散囊菌是一種真菌，屬于散囊菌目發菌科散囊菌屬，這種真菌經過“發花”后在磚茶中形成直徑在100～175 μm的金黃色“金花”顆粒，故又稱“金花菌”[2]。由于冠突散囊菌以茯磚茶為基質，經發酵使得茯磚茶的成分發生了變化，產生了氧化產物和水解產物，以及有機酸等活性物質，不僅形成了茯磚茶特有的色、香、味，也使茯磚茶具有調脂減肥、改善人體消化道功能、治療心血管疾病等保健功效[3]。

冠突散囊菌形成的“金花”顆粒與茯磚茶基質和其他種類雜菌形成的菌落有較大的差別，且由于具有諸多對人體有益的功效，“金花”在茯磚茶中的數量和質量是判斷茯磚茶質量優劣的一項重要且獨特的指標。本文針對茯磚茶茶體“金花”菌落中冠突散囊菌的數量進行計數檢測，使用不同的取樣方法進行冠突散囊菌菌落的取樣，并采用多種培養基進行培養。在取樣方法的選擇上，由于地方標準《食品安全地方標準 涇陽茯磚茶》（DBS 61/0006—2014）中并未規定取樣方法，本文采取傳統五點法作為第一種取樣方法。由于傳統五點法的取樣位置較為固定和集中，針對分散分布的菌落進行采樣時難免發生錯漏，有一定局限性，所以選擇對角線五點法作為第二種取樣方法，兩種取樣方法互為對比和補充。冠突散囊菌的檢驗方法依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（GB 4789.15-2016）[4]。但該法中采用的培養基及培養條件并非冠突散囊菌的最適生長條件，且取樣方法并不能準確地體現茶葉中冠突散囊菌的實際含量，對冠突散囊菌的檢測針對性也不強。所以在《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016）所規定的檢驗方法上加以改進，在該標準規定的兩種瓊脂培養基的基礎上，添加更適于真菌培養的察氏培養基作為培養基方面的對比方案。綜上，本文旨在研究冠突散囊菌在3種培養基，即孟加拉紅瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基和察氏培養基上的生長情況，并且將傳統五點法取樣和對角線五點法取樣兩種取樣方法對冠突散囊菌生長的影響進行對比。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

14批次茯磚茶樣品均來自陜西市場市售，編號為01～14。茯磚茶樣品的采集和制備過程均符合《緊壓茶 第3部分:茯磚茶》（GB/T 9833.3—2013）[5]中對茯磚茶感官品質、理化指標、衛生指標等的要求。

孟加拉紅瓊脂培養基、PDA培養基、察氏培養基均來自北京陸橋技術股份有限公司；霉菌培養箱為上海新苗醫療器械制造有限公司生產的MJ-250BSH-Ⅱ型環保型霉菌培養箱，該型培養箱溫度波動范圍為±0.5 ℃，滿足《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016）對培養箱溫度波動范圍不大于±1 ℃的要求；均質器采用寧波新芝生物科股份有限公司生產的SCIENTZ-Ⅱ超聲波細胞粉碎機；電子天平、無菌吸管、無菌試管、恒溫水浴箱和顯微鏡等其他試驗設備和材料的選擇均滿足《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016）的要求。

1.2 實驗方法

1.2.1 3種培養基比對

（1）取樣。在研究3種培養基對冠突散囊菌的影響時，取樣方法統一采用傳統的五點法取樣，即距離茯磚茶四角1 cm處的4個點取樣、茯磚茶中心點取樣，每個點取樣5 g左右。

（2）稀釋和培養。檢測方法依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016）。稱取25 g樣品，加入225 mL無菌生理鹽水，用拍擊式均質器拍打1 min制成10-1的樣品勻液。取1 mL 10-1的樣品勻液注入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，在旋渦混合器上混勻，即為10-2的樣品勻液，依次稀釋得到10-3、10-4、10-5樣品勻液。選擇10-3、10-4、10-5樣品勻液，每個稀釋度分別吸取1 mL于2個無菌平皿內，同時分別取1 mL無菌生理鹽水加入2個無菌平皿作空白對照。由于要比對3種培養基，每個稀釋度應做3份樣液。加樣完成后，及時將20～25 mL冷卻至46 ℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、孟加拉紅瓊脂培養基、察氏培養基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻，待凝固后置（28±1）℃培養箱中培養。從第3 d開始每天觀察并記錄結果直至培養至第5 d，選取菌落數在10～150 CFU的平板進行計數。

1.2.2 兩種取樣方法比對

在研究兩種取樣方法的影響時，培養基統一采用孟加拉紅瓊脂培養基。分別采用傳統五點法和對角線五點法取樣，傳統五點法的取樣過程見1.2.1（1）。對角線五點法的取樣過程為選取茯磚茶茶體矩形的任一條對角線（本文統一選取左對角線）在其上均勻選取五點進行取樣，每個點取樣5 g左右，其中首尾兩點須距離茯磚茶兩角1 cm。稀釋和培養的步驟見1.2.1（2）。

2 結果與分析

2.1 培養基比對

由表1可知，根據14組樣品的菌落計數結果進行分析，發現在孟加拉紅瓊脂培養基和PDA培養基上所培養的冠突散囊菌菌落計數相差不大，而在察氏培養基所培養的菌落計數則普遍結果更大。此外，察氏培養基不僅計數結果偏大，其上的“金花”形態較孟加拉紅瓊脂培養基和PDA培養基上的也要更大，形態更加不規則，不便于冠突散囊菌菌落的計數。孟加拉紅瓊脂培養基和PDA培養基是常用的霉菌、酵母菌計數培養基，而察氏培養基則常用于霉菌、真菌的鑒定。根據對3種培養基上菌落計數數據和菌落形態的分析，察氏培養基不適合作為冠突散囊菌菌落的計數培養基，而孟加拉紅瓊脂培養基和PDA培養基則均比較適合作為冠突散囊菌菌落計數培養基。

表1 3種培養基所測冠突散囊菌含量

2.2 取樣方法比對

由表2可知，即使取樣方法同為傳統五點法或同為對角線五點法，依然存在同一檢驗員檢測數據重復性較差、同一組樣品結果不一致且不呈現任何規律性的問題。一些茯磚茶樣品從外觀上來看，“金花”菌落分布不均勻，且無論采取傳統五點法還是對角線五點法均存在取樣不均勻的問題。“金花”菌落位于茯磚茶的磚面和磚底的中部，磚表面1 cm區域通常沒有或極少有“金花”菌落的生長，故取樣位置不正確，極易造成冠突散囊菌菌落漏檢或菌落計數檢測不準確[6]。這一點對于規格較小的茯磚茶茶體樣品（定義為重量低于100 g的樣品），無論傳統五點法和對角線五點法都存在取樣困難、檢測準確度低的問題。

表2 2種取樣方法所測冠突散囊菌含量

2.3 操作要點分析

茯磚茶茶體樣品中冠突散囊菌菌落計數的檢測采用《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016）。采用該標準在操作時需要注意的事項有：①必須用拍擊式均質器均質1～2 min，不可僅手動搖勻；②梯度稀釋時每個稀釋度的試管必須在渦旋混勻儀上混勻5～8 s，不可僅手動搖勻。這是因為樣品若不均質或混勻，冠突散囊菌的孢子無法充分釋放到稀釋液中，易造成檢測結果菌落數偏低或偏高，菌落計數檢測結果失真。

3 結論

綜上，察氏培養基不適合作為冠突散囊菌菌落計數的培養基，而取樣方法對冠突散囊菌菌落計數的影響不明顯，且受到取樣人員手法、茯磚茶樣品菌落分布不均勻等因素的影響較大。