羥基磷灰石負(fù)載黃芩苷的不同載藥方法比較分析

劉暢，李玉寶，左奕，李吉東

（四川大學(xué)分析測試中心，四川 成都 610065）

黃芩苷（baicalin，BA）是一種存在于黃芩植物根莖葉中的黃酮類化合物，具有抑菌、抗炎等生物活性，能夠通過激活機體免疫系統(tǒng)識別、殺傷和清除腫瘤細(xì)胞。近年來，研究發(fā)現(xiàn)BA 可促成骨相關(guān)細(xì)胞的成骨分化。然而BA 為難水溶性藥物，生物利用率低，大大限制了其臨床應(yīng)用。羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA），化學(xué)式為Ca(PO)(OH)，是動物骨骼和牙齒的主要無機成分，因其具有良好的生物相容性、離子交換性和骨傳導(dǎo)/骨誘導(dǎo)等性能，廣泛用作骨修復(fù)材料和藥物載體。使用羥基磷灰石負(fù)載BA，不僅可以起到局部緩釋的目的，增加BA 在體內(nèi)的局部生物利用率，還可賦予羥基磷灰石更好的成骨活性，在促進(jìn)骨再生修復(fù)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。目前，尚未有HA負(fù)載BA的相關(guān)研究報道。大量研究表明，BA 在強酸強堿、高溫等環(huán)境中容易變性失活，所以選擇合適的途徑進(jìn)行藥物負(fù)載十分重要。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

磷酸肌酸、BA（純度95%）購于大連美侖生物技術(shù)有限公司；磷酸緩沖液片劑購于北京索萊寶科技有限公司；硝酸鈣[Ca(NO)·4HO]、磷酸三鈉（NaPO·12HO）、聚乙二醇（PEG400）、氫氧化鈉（NaOH）、氯化鈣（CaCl·2HO）及其他試劑均購于成都市科隆化學(xué)品有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（BT25S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，中國）；行星式球磨機（QM-3SP04，南京大學(xué)儀器廠，中國）；多通量密閉微波化學(xué)工作站（MDS-6G，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司，中國）；小型噴霧干燥機（SPRAY-2000，上海熙揚儀器有限公司，中國）；智能恒溫培養(yǎng)振蕩器（HNY-100B，天津歐諾儀器股份有限公司，中國）；低速離心機（LD4-2A，北京雷勃爾離心機有限公司，中國）；真空冷凍干燥機（LGJ-12，北京松源華興科技發(fā)展有限公司，中國）；掃描電子顯微鏡（SEM；JSM-6510LV，JEOL 公司，日本）；透射電子顯微鏡（TEM；Tecnai G2F20 S-TWIN，F(xiàn)EI 公司，美國）；X 射線衍射儀（XRD；DX-2500，丹東方圓儀器有限公司，中國）；傅里葉紅外光譜儀（FTIR；Nicolet 6700，Thermo 公司，美國）；紫外分光光度計（UV-1000，翱藝儀器有限公司，中國）。

1.3 不同形貌羥基磷灰石合成與BA負(fù)載

1.3.1 nHA的合成

分別配制0.5mol/L 的四水硝酸鈣和0.3mol/L 的十二水磷酸三鈉水溶液，按照一定比例將鈣源溶液緩慢滴加到磷源溶液中，在70℃水浴條件下以900r/min 速率快速剪切乳化1h，并用4mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)溶液pH 穩(wěn)定在10±0.1，持續(xù)攪拌1h確保反應(yīng)完全，靜置陳化24h后使用磷酸緩沖溶液（PBS）將羥基磷灰石清洗至pH為中性，離心后冷凍干燥獲得納米棒狀羥基磷灰石。

1.3.2 mHA的合成

分別配制一定濃度的磷酸肌酸和二水氯化鈣水溶液，按比例將磷源溶液緩慢滴加入鈣源溶液中，滴加前使用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)鈣源溶液pH 穩(wěn)定在10±0.1，持續(xù)攪拌1h，將混合好的溶液取40mL 轉(zhuǎn)移至單個微波反應(yīng)釜內(nèi)密封，在120℃條件下反應(yīng)30min，靜置陳化，使用去離子水洗滌至pH 呈中性，離心后冷凍干燥獲得微米球狀羥基磷灰石。

1.3.3 nHA和mHA吸附負(fù)載BA

使用PBS 分別配制不同濃度的BA 溶液，取3mL 配制的BA 溶液放入塑料EP 管，稱量5mg 的nHA 或mHA 加入溶液中并密封容器，置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中震蕩24h，離心后取沉淀冷凍干燥得到載BA 的羥基磷灰石，命名為“nHA/mHA+數(shù)字”，如nHA100 代表使用nHA 吸附載藥時BA 溶液濃度為100μg/mL。

1.3.4 一步法制備負(fù)載BA的mHA

按照1.3.2節(jié)配制混合溶液，使用NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液的pH分別為7.5、8、9和10，并在轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜的溶液中添加2mg的BA，反應(yīng)后得到的載藥羥基磷灰石分別命名為BHA(7.5)、BHA(8)、BHA(9)和BHA(10)，BHA 即BA-loaded Hydroxyapatite，括號內(nèi)的數(shù)字代表反應(yīng)時溶液的pH。

1.3.5 nHA噴霧干燥負(fù)載BA

配制100g/L 的nHA 懸濁液，球磨20min 后在進(jìn)口溫度150℃、出口溫度60℃的條件下噴霧干燥，得到干燥的球狀羥基磷灰石，命名為MHA（microspheric hydroxyapatite）。分別添加2.5%、5%和10%的BA至配制好的nHA懸濁液中，混合均勻后噴霧干燥，得到的載藥球狀羥基磷灰石分別命名為2.5MHA、5MHA和10MHA。

1.4 材料的理化和藥物負(fù)載性能表征

將無水乙醇超聲分散的樣品粘在樣品臺上，噴金2min，采用SEM 在工作電壓20kV，工作距離10mm的條件下觀察樣品形貌。采用TEM觀察鍍碳膜銅網(wǎng)上分散的樣品的超微結(jié)構(gòu)。采用X射線衍射儀對制備的顆粒進(jìn)行物相分析，分析條件為Cu K射線源（=0.15418nm），管電壓40kV，管電流25mA，掃描角度范圍2=5°～80°，掃描速率為0.03°/min。采用傅里葉紅外光譜儀對樣品中所含官能團(tuán)進(jìn)行分析，掃描范圍4000～400cm，分辨率0.05cm。通過Image J 軟件隨機測量SEM 圖像視野中100 個顆粒的直徑，并統(tǒng)計分析粒徑分布。

采用紫外分光光度計在=275nm條件下對不同藥物濃度的PBS 溶液進(jìn)行吸光度檢測，繪制出BA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過檢測1.3.3節(jié)中離心后的上清液的吸光度計算獲得載藥量。包封率由載藥量進(jìn)一步通過式(1)計算得出。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種不同羥基磷灰石的理化性能

通過化學(xué)沉淀法和微波水熱法制備了兩種形貌的羥基磷灰石，nHA 和mHA。如圖1(a)和(b)所示，nHA 呈均勻的短棒狀，寬度約20nm，長度40～150nm，mHA呈類海膽狀的微球，球的直徑尺寸約為1.5μm。

FTIR光譜[圖1(c)]證實nHA和mHA均具有羥基磷灰石的特征官能團(tuán)。其中，3570cm處的峰歸屬于羥基磷灰石本身含有的羥基基團(tuán)；3421cm和1635cm處的羥基的寬峰是樣品粉末接觸空氣吸收水分所導(dǎo)致；1039cm、964cm、606cm和567cm處的峰屬于PO3的特征峰；1415cm和1465cm處的峰屬于CO2的不對稱伸縮振動的雙分裂峰，870cm附近為CO2的AB混合型取代面外彎曲振動特征峰，這三個峰的出現(xiàn)是由于合成過程中空氣中的二氧化碳少量進(jìn)入到磷灰石晶格中。

通過XRD[圖1(d)]可以證實，樣品粉末的主要衍射峰與羥基磷灰石標(biāo)準(zhǔn)卡片（JCPDS 09-0432）的特征峰基本吻合，可以在2為25.9°、31.678°、32.15°與33.989°處觀察到對應(yīng)(002)、(211)、(112)和(202)晶面的衍射峰，表明制得的nHA 和mHA 均為高純度的羥基磷灰石，而且微量的CO2摻入并沒有導(dǎo)致結(jié)晶相的明顯變化。

圖1 nHA和mHA的理化性能

2.2 nHA和mHA吸附負(fù)載BA

圖2結(jié)果顯示mHA具有更高的載藥能力[(a)]和藥物包封率[(b)]，這可能是由于羥基磷灰石微球表面具有豐富的介孔和較大的比表面積，有更好的藥物吸附能力。因此，本文作者團(tuán)隊優(yōu)選出mHA 為載體，考察載藥時BA 的濃度分別為100μg/mL、1500μg/mL、3000μg/mL時對mHA載藥行為的影響。

圖2 nHA和mHA吸附負(fù)載BA的載藥量和包封率

如圖3(a)～(c)所示，mHA吸附負(fù)載BA后沒有改變其本身的球狀形貌，載藥羥基磷灰石微球的粒徑主要分布在1～1.5μm 之間[見圖3(d)～(f)]。紅外光譜[圖3(g)]結(jié)果可以觀察到載藥mHA 出現(xiàn)了新的吸收峰，1660cm處的吸收峰對應(yīng)黃酮類化合物的共軛羰基，1616cm是苯環(huán)C==C 鍵伸縮振動吸收峰，1589cm和1450cm處的吸收峰屬于苯環(huán)骨架振動，1359cm和767cm處的吸收峰分別對應(yīng)C—H對稱彎曲以及苯環(huán)單取代C—H鍵引起的面外彎曲振動，表明mHA 通過吸附成功負(fù)載了BA，并且隨著溶液中BA 濃度增大，載藥微球顯示出更強的屬于BA的吸收峰。XRD譜圖[圖3(h)]結(jié)果顯示吸附負(fù)載BA 沒有改變微球狀羥基磷灰石的晶體結(jié)構(gòu)，因為藥物負(fù)載量較少，也沒有觀察到明顯的藥物BA的衍射峰。

圖3 不同BA濃度溶液中制備的載BA的mHA理化性能

盡管研究發(fā)現(xiàn)微球狀羥基磷灰石較納米棒狀羥基磷灰石有相對更高的吸附載藥效率，且這種吸附負(fù)載BA 的方式能最大程度地保證藥物活性，但載藥步驟煩瑣、操作耗時。因此，需進(jìn)一步尋找簡便、高效的制備羥基磷灰石負(fù)載BA的新方法。

2.3 一步法制備載BA的羥基磷灰石微球

微波水熱法能夠克服傳統(tǒng)水熱容器加熱不均勻的缺點，縮短反應(yīng)時間，提高工作效率，避免羥基磷灰石的合成過程中存在滯后效應(yīng)。由圖4(a)～(c)可以看出，通過一步微波水熱法制得的羥基磷灰石均呈現(xiàn)均勻的球形，然而BHA(10)呈現(xiàn)不均勻的團(tuán)聚物形態(tài)[圖4(d)]，出現(xiàn)大量不規(guī)則的沉淀物（箭頭所指）。圖4(e)～(g)表明微波水熱法制備得到的BHA 具有微米級尺寸，粒徑主要分布在1～1.5μm之間，而BHA(10)的團(tuán)聚物卻具有1.0～2.5μm的寬廣分布[圖4(h)]。XRD 譜圖[圖4(i)]結(jié)果顯示，合成得到的BHA 在8°～26°范圍內(nèi)出現(xiàn)了不同程度的雜質(zhì)峰（虛線框所示）。FTIR 結(jié)果[圖4(j)]表明，不同pH 條件下合成的BHA 均沒有檢測到BA 的特征峰。這是由于前體溶液堿性較強，BA 會發(fā)生水解并析出沉淀，BA大量變性失活，BHA中BA的殘余含量很低，F(xiàn)TIR 無法檢測到BA 的特征吸收峰。

圖4 不同pH條件下合成的載藥mHA的理化性能

通過微波水熱法一步制備負(fù)載BA 的微米球狀羥基磷灰石雖然操作簡單，但是BA 在前體溶液中極不穩(wěn)定，容易分解成為其他物質(zhì)，破壞了藥物的結(jié)構(gòu)，大大降低羥基磷灰石負(fù)載BA 的生物活性。因此，該方法不適合用于制備負(fù)載BA 的羥基磷灰石復(fù)合物。

2.4 噴霧干燥法制備負(fù)載BA的羥基磷灰石

噴霧干燥法是制備羥基磷灰石微球的方法之一，這種方法簡單快捷，可以連續(xù)高效制得羥基磷灰石微球，易于工業(yè)化生產(chǎn)。SEM 觀察[圖5(a)～(h)]顯示，MHA 和負(fù)載了不同含量BA 的MHA 均具有較好的球形，微球直徑主要分布在2～8μm 之間[圖5(i)～(l)]，BA的負(fù)載沒有明顯改變微球的形貌。

圖5 噴霧干燥法制得的羥基磷灰石微球的SEM圖像及粒徑分布圖

FTIR光譜[圖6(a)]中觀察到明顯的BA特征吸收峰，證實了BA的成功負(fù)載及活性保持。XRD結(jié)果[圖6(b)]顯示，噴霧干燥負(fù)載BA的方式并沒有改變羥基磷灰石的晶體結(jié)構(gòu)，BA 可能主要以非晶形式分布在微球中，所以沒有觀察到BA 的特征衍射峰。TG 分析結(jié)果[圖6(c)]顯示，MHA 在550℃升溫范圍內(nèi)有6.05%的質(zhì)量損失，這是由于吸附水和結(jié)合水從樣品中移除；而2.5MHA、5MHA、10MHA 在相同條件下除去失水外的實際質(zhì)量損失分別為2.52%、5.53%、9.30%，這與三組樣品中BA 的添加量基本一致，證明噴霧干燥的方法可以實現(xiàn)近100%的藥物包封率。

圖6 噴霧干燥法制得的MHA及負(fù)載BA的理化性能

噴霧干燥的方法避免了強酸強堿溶液對藥物的影響，而且由于溶劑（去離子水）的沸點為100℃，BA 的熔沸點為233℃左右，調(diào)整進(jìn)口溫度介于水溶劑和BA 的熔沸點之間，既能夠維持藥物的穩(wěn)定性，又可以保證成球和藥物負(fù)載的效果。

3 結(jié)論

（1）FTIR 圖譜分析、TEM 觀測以及XRD 譜圖結(jié)果表明，通過化學(xué)沉淀法和微波水熱法合成的nHA 和mHA 均具有典型的羥基磷灰石晶體結(jié)構(gòu)，兩種羥基磷灰石的組成、結(jié)構(gòu)無明顯差別，形貌分別呈棒狀和球狀。

（2）載藥量曲線、包封率曲線和FTIR 圖譜等結(jié)果顯示，nHA 吸附負(fù)載BA 的方法條件溫和、結(jié)果穩(wěn)定，然而步驟煩瑣耗時，載藥量和包封率較低。

（3）SEM 圖像和XRD 譜圖等結(jié)果表明，微波水熱一步法合成負(fù)載BA 的羥基磷灰石微球的方式步驟簡單，條件易控，但是BA 極易在前體溶液中失活，嚴(yán)重影響載藥效果。

（4）本文通過噴霧干燥法制備負(fù)載BA 的羥基磷灰石微球，制備工藝簡單，批次間重復(fù)性好，TG 失重曲線等結(jié)果證實該方法可以在維持藥物活性的同時實現(xiàn)近100%的負(fù)載效率，適合實驗室和工業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)。