硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的合成及體外抗氧化活性研究

＊李學麗 胡青青 馮德日

（沈陽醫學院 遼寧 110034）

谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）是體內一種非常重要的抗氧化酶，其可以有效的清除活性氧自由基（ROS），防止組織細胞內的脂質過氧化和衰老現象[1-2]。GPX酶活性中心的催化基團主要是硒代半胱氨酸（Se-Cys）基團，特別是金屬硒（-Se）基團的催化作用對于GPX的抗氧化活性非常關鍵。目前，已有多項臨床研究表明，人體內GPX活性的下降及缺失與心腦血管疾病、克山病及多種腫瘤疾病的發生密切相關[3-5]。

4-叔丁基杯[4]芳烴是由苯酚單元通過亞甲基在酚羥基鄰位連接而成的環狀小分子聚合物。由于其具有分子量小、包含多個活性基團而更易于進行多種化學修飾等特點，4-叔丁基杯[4]芳烴目前已成為繼環糊精和冠醚之后廣受矚目的第三代有機合成超分子[6,7]。在4-叔丁基杯[4]芳烴的空間結構中，其內部具有一個由4個苯酚單元所圍成的疏水腔結構，該結構類似于催化酶活性中心的底物結合部位結構，非常有利于其作為模擬酶與多種酶的催化底物相結合的作用。同時其4個苯酚單元的結構下緣都各有1個羥基（-OH）活性基團，可以進行多種化學修飾，引入各種模擬酶的催化基團。

在我們的研究中，我們以4-叔丁基杯[4]芳烴疏水腔結構下緣苯酚單元的-OH基團為修飾靶點，在其結構中引入了GPX酶的關鍵催化基團-金屬硒（-Se），首次合成了一種新的GPX模擬物—硒代4-叔丁基杯[4]芳烴，合成路線見圖1。此外，我們還建立了由Fe2+/Vc誘導的牛心線粒體損傷體系，對硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的體外抗氧化GPX活性進行了進一步的研究[8-10]。

圖1 硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的合成路線

1.實驗部分

(1)試劑與儀器

①試劑。4-叔丁基杯[4]芳烴、對甲苯磺酰氯（p-TsCl）、硼氫化鈉（NaBH4）、硫代巴比妥酸、抗壞血酸購自為國藥集團公司，硒（Se）、谷胱甘肽（GSH）、輔酶（NADPH）、谷胱甘肽還原酶（RD）購自Sigma公司產品，其它均為國產分析純試劑直接使用。

②儀器。Bruker-300型核磁共振儀，Agilent 7890A-5975C型ESI-MS質譜儀（甲醇為溶劑），UV-3100型紫外-可見光分光光度計，KH22R型高速冷凍離心機。

(2)硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的制備與純化

①化合物2的合成

在三口燒瓶中，將2.0g 4-叔丁基杯[4]芳烴溶于40mL DCM溶液中，加入1.2mL三乙胺后，0℃滴加P-TsCl的乙腈溶液（2.5g/5mL）。室溫攪拌反應12h后，蒸出大部分溶劑，向殘留物中加入30mL氯仿和1M的稀鹽酸，攪拌10min，加入碳酸氫鈉溶液水洗有機相至pH為中性，有機相用無水硫酸鎂干燥，過濾，蒸出大部分的氯仿，加入甲醇，有白色沉淀生成，過濾，沉淀用甲醇重結晶，得到2.42g白色粉末，產率為83%，mp176.0～177.4℃；1HNMR（CDCl3，400MHz）δ:7.56（bs，2H，OH），7.22（s，4H，ArH），6.88（b s，8 H，A r H），6.7 2（s，4 H，A r H），4.2 6（d，4H，ArCH2Ar），3.28（d，4H，ArCH2Ar），1.56（s，6H，ArCH3），1.30［s，18H，C（CH3）3］，0.99［s，18H，C（CH3）3］；ESI-MS，m/z:956.32[M+HI+]。

②化合物3的合成

用文獻[5]方法制備NaHSe后，將100mg化合物2溶解于20mL DMF/H2O（V:V=1:1）中，在高純氮氣保護下加入2mL 1mol/L NaHSe，60℃攪拌反應36h。反應結束后用DCM萃取反應液并保留有機相，有機相再依次用水和飽和食鹽水萃取，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸干，得淡黃色油狀物83mg，產品進一步經硅膠柱層析純化，洗脫液為石油醚/乙酸乙酯（V:V=5:1），最終得淡黃色固體57mg，產率72%，mp157.2～158.5℃；1HNMR（CDCl3，400MHz）δ:7.65（bs，2H，OH），7.25（s，4H，ArH），6.75～6.80（s，4H，ArH），4.28（d，4H，ArCH2Ar），3.29（d，4H，ArCH2Ar），1.32［s，18H，C（CH3）3］，0.95［s，18H，C（CH3）3］；ESI-MS，m/z:774.23[M+HI+］。

(3)硒代4-叔丁基杯[4]芳烴GPX活力的測定

我們采用文獻[2]GPX活性的標準測定方法對模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的GPX活性進行測定，并將該模擬物的GPX活性分別與天然GPX酶及其他幾種GPX模擬物的GPX活性進行比較。其中每分鐘每消耗1μmol/L NADPH所需要模擬物的量定義為一個GPX酶活力單位。

(4)硒代4-叔丁基杯[4]芳烴抗體外線粒體氧化損傷活性的測定

①建立由Fe2+/Vc誘導的體外牛心線粒體損傷評價體系。我們首先在體外制備多種不同的由Fe2+/Vc誘導的牛心線粒體損傷評價體系：在20ml pH7.4的磷酸鉀緩沖溶液中，分別加入氯化鉀（0.125mol/L）、氯化鎂（0.001mol/L）、谷氨酸鈉（0.005mol/L）、谷胱甘肽（1μmol/L）、牛心線粒體（0.5mg/ml）以及不同質量濃度的模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴（質量濃度分別為0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L），37℃保溫30min，然后分別向各反應體系中加入Vc（0.0005mol/L）和FeSO4（12.5μmol/L）試劑誘導線粒體損傷反應。其中，不加入Vc和FeSO4誘導的線粒體損傷體系為空白對照組，在加入Vc和FeSO4誘導的線粒體損傷體系中模擬物濃度為0μmol/L的體系為損傷組，模擬物濃度分別為1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L的體系為模擬物抗氧化保護組。

②損傷線粒體膜膨脹度的測定。分別測定各損傷體系中線粒體膨脹度的變化值，參考文獻[9]。

③丙二醛生成量的測定。分別測定各損傷體系中線粒體脂質過氧化反應的終產物-丙二醛（MDA）生成量，參考文獻[9]。

④細胞色素C氧化酶活力值的測定。參考文獻[10]的方法，分別測定各損傷體系中的細胞色素C氧化酶（CCO）活性值的變化。

2.結果和討論

(1)硒代4-叔丁基杯[4]芳烴與其他幾種GPX模擬物的活性比較

經測定，硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的GPX活力達到了137.22U/μmol，雖然其GPX活力與天然GPX酶的5780U/umol酶活力值仍有不小的差距，但在與其他已合成的GPX模擬物的活性比較中，硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的GPX活性明顯增強，結果見表1。

表1 不同GPX模擬物的酶活性比較

(2)硒代4-叔丁基杯[4]芳烴對線粒體氧化損傷的保護作用

①硒代4-叔丁基杯[4]芳烴可以抑制損傷線粒體外膜的膨脹。線粒體在遭受氧化損傷的過程中，最明顯的變化是其線粒體外膜會發生明顯的膨脹現象，從而導致整個線粒體損傷體系的渾濁度升高，光吸收能力下降。從圖2中我們可以發現，加入模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴后的線粒體損傷體系保護組與損傷組相比，其線粒體外膜的膨脹現象明顯減弱，且隨著模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴濃度的增加，其對于損傷線粒體外膜膨脹的抑制作用越來越顯著。在4μmol/L硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的保護組中，20min后，其線粒體外膜膨脹度的增長率僅為損傷組的28%。

圖2 不同濃度硒代4-叔丁基杯[4]芳烴對損傷線粒體膨脹抑制作用的活性比較

②硒代4-叔丁基杯[4]芳烴可以抑制損傷線粒體中丙二醛的生成。在線粒體遭受氧化損傷的過程中，大量線粒體外膜中的脂類物質會發生明顯的脂質過氧化現象，丙二醛（MDA）是線粒體脂質過氧化反應的終產物。從圖3中我們可以明顯的發現，加入模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴后的線粒體損傷體系保護組可以明顯的抑制線粒體中MDA的生成，且保護組中模擬物的濃度越高，則抑制線粒體中MDA生成的能力越明顯，這也就意味著硒代4-叔丁基杯[4]芳烴可以有效的抑制損傷線粒體中脂質過氧化現象的發生。

圖3 不同濃度硒代4-叔丁基杯[4]芳烴對損傷線粒體MDA生成抑制作用的活性比較

③硒代4-叔丁基杯[4]芳烴可以保護損傷線粒體中細胞色素C氧化酶的活性。我們的實驗結果見圖4，我們將沒有加入Vc和FeSO4誘導的線粒體反應體系做為空白對照組，定義其CCO酶活力為100%。在此基礎上我們發現，損傷組中線粒體CCO酶活力值隨著損傷時間的延長，其CCO活力下降非常明顯，60min后其CCO活力僅為空白對照組的43%。而相應的，在加入模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴后的線粒體損傷體系保護組中我們可以發現，不同濃度的模擬物都可以對損傷線粒體中CCO活力值的降低起到一定的抑制作用，且模擬物濃度越高，則其對線粒體CCO活力的保護作用越明顯。

圖4 不同濃度硒代4-叔丁基杯[4]芳烴對損傷線粒體CCO活力保護作用的活性比較

3.結論

我們基于4-叔丁基杯[4]芳烴的結構特點，在其具有GPX底物結合部位所需的疏水腔結構的基礎上，以其結構下緣苯酚單元中的-OH基團為修飾靶點，將GPX酶關鍵催化基團-金屬硒（-Se）基團引入到其結構中，首次合成了一種新的GPX模擬物-硒代4-叔丁基杯[4]芳烴，目前該模擬物結構還未見其他文獻報道。按照標準的Wilson酶活力測定方法，我們測定該模擬物的GPX抗氧化活性達到了137.22U/μmol，與目前已合成的幾種GPX模擬物相比，其GPX活性得到了比較明顯的提高。同時，在該模擬物體外抗氧化活性的評價實驗中我們還發現，模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴對于由Vc/FeSO4誘導的線粒體氧化損傷現象具有明顯的抑制作用。其能夠有效的減少損傷線粒體外膜的膨脹破裂現象，抑制損傷線粒體中脂質過氧化產物MDA的累積，并維持損傷線粒體中CCO酶活力的穩定。這些實驗結果都充分表明，模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴具有良好的GPX抗氧化生物學活性。