超聲-DNA提取酚試劑-堿性蛋白酶協同提取污泥蛋白質的研究

＊崔靜 周濤 趙由才

（1.天津裕川錦鴻環保科技有限公司 天津 300459 2.同濟大學環境科學與工程學院 上海 200092）

近年來市政污泥產量隨污水處理規模而不斷攀升，以含水率為80%計算，預計到2025年，年污泥產量將超過6000萬噸[1]。剩余污泥高度親水，含水率高（95%～99%），且富含多種有機污染物、病原菌、重金屬等有毒有害物質，同時伴有惡臭氣體，因此必須對剩余污泥進行妥善地處理處置[2]。

從資源角度看，剩余污泥中含有30%～60%的蛋白質以及磷、鉀等營養元素，若加以分離則可作為有機肥、土壤調理劑、蛋白泡沫滅火劑等使用[3]。熱堿水解法作為一種高效的污泥蛋白質分離技術，通過加壓、加熱、加堿等操作水解破壞污泥細胞壁和菌膠團，并分離濃縮獲取其中蛋白質[4]，促使細胞膜破裂并釋放胞內蛋白質。酚抽提作為一種優良的蛋白提取方法，提高了蛋白質提取效率[5]。生物酶法利用酶的高效催化性能，對污泥細胞壁進行分解，從而析出胞內蛋白質[6]。基于此，本研究探究超聲-化學藥劑-蛋白酶協同處理對污泥熱堿混合液中蛋白質的二次提取效果，通過單因素控制變量試驗確定最佳蛋白酶種類和初始酶加量，并利用EPS和IS評估污泥的脫水性，旨在為實際工程運行提供參考和依據。

1.材料與方法

(1)污泥樣品和化學藥品

污泥混合液由天津某環保科技公司提供，取自熱堿工藝閃蒸處理出口，完整工藝流程及樣品來源如圖1所示。污泥混合液基本性質包括：含水率94.8%～96.2%，pH為12.30～12.46。

圖1 熱堿工藝流程及污泥樣品示意圖

DNA提取酚試劑（pH＞7.8，上海索萊寶生物科技有限公司），水解酶包括中性蛋白酶（BR，50U/mg）、堿性蛋白酶（200U/mg）、木瓜蛋白酶（＞200U/mg）和胰蛋白酶（＞2500U/mg），均購置于上海麥克林生化科技有限公司。

(2)超聲-DNA提取酚試劑-蛋白酶水解污泥實驗

首先向容量為1L的燒杯中加入500mL的污泥混合液，加入30mL（體積分數6%）的DNA提取酚試劑，用玻璃棒快速攪拌3min并置于漩渦混合儀上混合30s以保證藥劑與污泥充分混合。隨后加入一定質量比的蛋白酶，繼續置于漩渦混合儀上混合60s。待蛋白酶充分溶解后，將燒杯放于超聲清洗鍋（頻率40kHz，600W）中部進行超聲處理，時間20min，溫度38℃。反應結束后將水解液于90℃水浴鍋中滅酶處理15min，然后離心處理，轉速為4000rpm，離心時間為10min，取上清液過0.45μm濾膜獲得蛋白質濾液，并測定其蛋白質濃度。

采用單因素控制變量實驗探討蛋白酶種類和初始酶加量（1000～6000U/g污泥混合液）兩種變量因素的影響。

(3)物質提取及分析方法

EPS的提取采用熱提取法[7]，IS的提取采用熱Tris緩沖溶液法[8]；MLVSS的測定參照第四版《城市污水水質檢驗方法標準》[9]；多糖濃度采用苯酚-硫酸法進行測定[10]；蛋白質濃度的測定采用Frolund等[11]的改進型Lowery法進行測定；污泥IS中的TOC含量利用TN/TOC分析儀測定（島津、TOC V-CPN，5～50mg/L）。

2.結果與分析

(1)超聲-DNA提取酚試劑-蛋白酶協同水解單因素實驗研究

以單一超聲處理、超聲+DNA提取酚試劑、超聲+DNA提取酚試劑+中性蛋白酶三組進行控制變量實驗，結果如圖2所示。原樣中濾液蛋白質平均質量濃度為277.43mg/L，經超聲破碎后質量濃度增大至473.12mg/L，說明物理處理能有效促進污泥中蛋白質的釋放。超聲處理強化了體系的聲空化作用，同時利用水力剪切力和瞬態空化加速了污泥細胞壁的裂解[12]。DNA提取酚試劑聯合超聲處理后，濾液蛋白質平均質量濃度進一步增大至712.57mg/L，證明了化學藥劑作用能夠在超聲處理基礎上增大對于污泥的破解程度。

圖2 超聲-DNA提取酚試劑-蛋白酶協同處理對濾液中蛋白質濃度的影響

超聲、DNA提取酚試劑和中性蛋白酶聯合處理后，蛋白質質量濃度繼續增至794.86mg/L，略高于超聲協同DNA提取酚試劑組，相較于未處理組提高186.51%，這說明了酶的水解能夠與物理及化學作用相耦合，進一步促進微生物細胞壁的裂解，釋放出胞內外物質，從而達到蛋白質提取的目的。

(2)協同水解蛋白酶單因素實驗研究

①蛋白酶種類對于污泥蛋白質提取的影響

以外加的蛋白酶種類為變量因素，并維持超聲和DNA提取酚試劑處理條件不變，控制混合液的初始酶加量為3000U/g，結果如圖3所示。堿性蛋白酶組的濾液蛋白質質量濃度最高，平均為827.73mg/L，其次是中性蛋白酶，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的提取效果較差，表明不同蛋白酶具有不同的活性、作用位點以及與底物之間的相互作用，這均會導致對同一底物的水解效果具有明顯差異[12]。超聲+DNA提取酚試劑+胰蛋白酶或木瓜蛋白酶組濾液蛋白質濃度低于超聲+DNA提取酚試劑處理組。

圖3 蛋白酶種類對協同處理后濾液中蛋白質濃度的影響

②酶加量對于污泥蛋白質提取的影響

如圖4所示，隨著初始酶加量由1000U/g逐漸增大至4000U/g，濾液中蛋白質平均質量濃度也提高至883.43mg/L，相較于未加入蛋白酶組提高23.98%。此后，蛋白質質量濃度隨著初始酶加量的增加而趨于平緩，在酶加量為6000U/g時平均質量濃度為900.86mg/L，較4000U/g僅提高1.97%，這說明此時酶對污泥的水解能力已不再是提高蛋白質濃度的限制性因素。因此最佳的初始酶加量應設為4000U/g。

圖4 初始酶加量對協同處理后濾液中蛋白質質量濃度的影響

(3)協同處理前后污泥脫水性和穩定性評估

①EPS組分及含量分析

結果如圖5所示。協同處理前后S-EPS的平均濃度分別為1561.59mg/L和2864.01mg/L，遠高于LB-EPS和TB-EPS，這也說明經過熱堿處理后的原污泥混合液中，微生物細胞和污泥膠體之間的吸附結合作用已被破壞，TB-EPS和LB-EPS被溶解及釋放，從而導致細胞中多糖和蛋白質進入S-EPS中，而進一步地超聲-DNA提取酚試劑-堿性蛋白酶處理強化了這一現象。LB-EPS和TB-EPS的減少會促進污泥絮體水分的釋放和分離，因此處理后混合液的固液分離速率會大幅度提高。協同處理后，S-EPS中蛋白質與多糖的平均比值為0.45，高于處理前，這也有利于維持污泥體系長期穩定性。

圖5 協同處理前后污泥EPS組分和含量的變化

②IS含量分析

以IS含量為檢測指標，分析了污泥中微生物的活性，結果如圖6所示。污泥混合液中IS的濃度由54.16mgTOC/gVSS降至25.08mgTOC/gVSS，說明協同處理后污泥膠體中的微生物代謝作用進一步減緩，微生物細胞大量溶解或凋亡，從而釋放出蛋白質、多糖等物質，脫水性能得到改善。

圖6 協同處理前后污泥IS含量的變化

3.結論

（1）中性蛋白酶和堿性蛋白酶協同處理能促進對污泥蛋白質的提取效果，其中最優的蛋白酶種類為堿性蛋白酶。濾液蛋白質含量隨初始酶加量先快速增大后趨于平緩。綜合蛋白質含量、酶成本可確定最佳的酶加量為4000U/g，此時蛋白質含量為883.43mg/L，較于未加入蛋白酶組提高23.98%。

（2）超聲-DNA提取酚試劑-堿性蛋白酶協同處理后，污泥混合液的S-EPS含量升高83.44%，LB-EPS和TB-EPS分別降低33.11%和24.95%，同時SEPS中蛋白質與多糖的比值提高了100.40%，表明協同處理能夠有效提升污泥混合液的脫水性和穩定性。