基于UPLC-Q-Orbitrap-MS和網絡藥理學的覆盆子治療2型糖尿病作用機制研究

崔琳琳 袁曉梅 高艷紅 姜佳峰 關永霞

覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子RubuschingiiHu的干燥果實，含有黃酮類、酚酸類、三萜類、生物堿等多種活性成分，具有降血糖、抗腫瘤等多種藥理活性[1]。隨著社會技術的發展進步，液質聯用技術已廣泛應用于中藥的有效活性成分鑒定研究中，其具有高選擇性、高靈敏度和高精準度等特點，實現了色譜和質譜的優勢互補，對未知化合物的鑒定和識別展現出全面、精準的具大優勢[2-3]。網絡藥理學是系統生物信息學研究的重要工具，利用網絡可視化方法分析疾病與藥物及靶點間復雜的相互作用關系，具有整體性和系統性特點，目前已廣泛用于預測中藥調控機體生物網絡的作用機制研究中[4]。本研究采用超高效液相色譜串聯四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(UPLC-Q-Orbitrap-MS)技術對覆盆子中化學成分進行全面快速的鑒定，并結合網絡藥理學和分子對接技術探索其治療糖尿病的作用機制，以期為覆盆子的藥效物質基礎、質量控制及臨床應用等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥物

覆盆子(批號：200910)，購于安徽中藥飲片有限公司，經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為薔薇科植物華東覆盆子的干燥果實。

1.2 實驗試劑

山奈酚3-O-云香糖苷(批號：112007-201602)、鞣花酸(批號：111959-201903)、椴樹苷(批號：112000-201802)、槲皮素(批號：100081-201610)、金絲桃苷(批號：111521-201809)、山奈酚(批號：110861-201812)、蘆丁(批號：100080-201811)，均購自中國食品藥品檢定研究院；紫云英苷(批號：ps01137p-0025MG)，購自成都普菲德生物醫藥科技股份有限公司；乙腈、甲醇、甲酸均為質譜純，其余為分析純。

1.3 實驗儀器

UPLC-Q-Orbitrap-MS四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Ultimate 3000超高效液相色譜系統(美國Thermo Fisher Scientific公司)，XS105DU型電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)，DRHH-S6型數顯恒溫水浴鍋(上海雙捷實驗設備有限公司)，KS-5200DE型數顯恒溫超聲波清洗機(昆山潔力美超聲儀器有限公司)。

1.4 色譜條件

Waters CORTECS C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)；流動相：0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)梯度洗脫：0-5分鐘，10%～20%B；5-20分鐘，20%～30%B；20-50分鐘，30%～35%B；50-65分鐘，35%～40%B；65-95分鐘，40%～50%B；95-100分鐘，50%～60%B；流速：0.3 mL/min；進樣量1 μL；柱溫30℃。

1.5 質譜條件

離子源采用HESI源，霧化電壓3.5 kV，鞘氣流速：35 μL/min；輔助氣流速：10 μL/min；毛細管溫度350℃；輔助氣加熱溫度：310℃；掃描模式Full MS/dd-MS2 模式，采用正、負離子模式采集，掃描m/z范圍：100～1 500。

1.6 覆盆子活性成分和作用靶點收集

基于液質聯用獲得的化學成分，通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)對成分進行篩選和補充，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug like，DL)≥0.15為篩選條件，獲得活性化合物及其作用的蛋白質靶點，篩選結束后，為標準化蛋白質靶點信息，統一在Uniprot蛋白質數據庫(https://www.uniprot.org)將化合物作用的蛋白質靶點進行規范。

1.7 2型糖尿病相關靶點收集

以“Type 2 diabetes mellitus”為關鍵詞，應用GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)、OMIM數據庫(http://www.omim.org)、DrugBank數據庫(https://www.drugbank.ca)得到2型糖尿病相關靶點。

1.8 PPI網絡的構建

為明晰覆盆子成分相關靶點與2型糖尿病靶點間的相互作用，將二者靶點取交集并繪制韋恩圖。進一步將交集靶點提交至STRING11.0數據庫(https://string-db.org)構建PPI網絡模型，利用Cytoscape3.7.1軟件繪制PPI網絡圖。

1.9 活性成分—疾病靶點生物功能與通路富集分析

將潛在靶點導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)，物種選擇為“Homo sapiens”，進行基因本體論(Gene ontology，GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，建立數據文件，利用Cytoscape3.7.1軟件構建“成分-靶點-通路”網絡。

1.10 分子對接驗證

對覆盆子核心成分和PPI網絡得到的核心靶點進行分子對接驗證。從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫下載核心成分對應小分子配體的2D結構圖，通過PyMOL軟件將其轉化為3D結構，從RCSB PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)下載核心靶點對應的大分子受體蛋白的3D結構，通過PyMOL軟件對其移除溶媒和配體分子，并導入AutoDockTools進行加氫等預處理。使用AutoDockTools確定受體蛋白對接區域后，最終運行AutoDockVina1.1.2對受體和配體進行分子對接并計算結合能，利用PyMOL對模型進行可視化。

2 結果

2.1 覆盆子化學成分分析

取覆盆子供試品溶液及混合對照品溶液，按1.4、1.5項下條件進樣分析，得到正、負離子質譜圖，見圖1、圖2。使用Xcalibur 3.0軟件對質譜信息進行數據分析，結合相關文獻報道及對照品進行化合物鑒別[5-9]，鑒定出36種成分，其中黃酮類成分16個，鞣質類成分12個，酚酸類成分8個，見表1。

圖2 覆盆子負離子模式下總離子流圖

表1 覆盆子主要化學成分表

續表

續表

2.2 活性成分與靶點信息

通過數據庫篩選，共篩選覆盆子活性成分8種，潛在靶點155個，獲得疾病相關靶點1882個。將覆盆子8種活性成分與155個潛在作用靶點導入Cytoscape3.7.1軟件中構建“活性成分-關鍵靶點”網絡圖。網絡中共涉及163個節點(靶點蛋白)和242條邊(蛋白相互作用)，其中倒三角代表活性成分，菱形代表關鍵靶點。根據網絡的拓撲學性質，對網絡進行度值評價，篩選重要成分共4種(度值≥17)，有槲皮素、山奈酚、甾谷醇和鞣花酸，推測其是覆盆子治療2型糖尿病的關鍵成分。見圖3。

圖3 覆盆子活性成分-靶點網絡圖

2.3 PPI網絡的構建

將篩選的覆盆子活性成分靶點與疾病靶點取交集，并繪制韋恩圖，進而將靶點提交至STRING11.0平臺，將STRING11.0數據庫中獲得的靶點蛋白相互作用數據導入Cytoscape3.7.1軟件繪制PPI網絡。PPI網絡中共有97個節點，776條邊。

節點大小和顏色深淺代表度值的大小，節點越大，顏色越深，其對應的度值越大；邊的粗細程度代表結合分數，邊越粗則結合分數值越大。在該網絡中，節點平均度值16，大于平均度值的核心節點共有36個，其中Akt1、IL6、TP53、TNF、VEGFA、MAPK1和JUN靶點蛋白度值較高(>40)，是關鍵靶點，這提示覆盆子可能通過這些靶點網絡發揮作用，同時也提示著各成分之間可能存在的協同作用。見圖4、圖5。

圖4 覆盆子治療2型糖尿病相關靶點韋恩圖

圖5 覆盆子治療2型糖尿病的潛在作用靶點相互作用網絡圖

2.4 GO富集分析和KEGG通路分析

對覆盆子治療2型糖尿病的核心靶點進行GO分類和KEGG富集分析，GO功能富集包括生物過程、細胞組分和分子功能3個部分，其中生物過程主要涉及對脂多糖的反應、炎癥反應、活性氧代謝過程、上皮細胞增殖等；細胞組分主要涉及膜筏、細胞質核周區、細胞外基質和質膜蛋白復合物等；分子功能主要涉及DNA結合轉錄因子結合、蛋白質同二聚化活性、細胞因子受體結合和蛋白域特異性結合等。KEGG結果顯示主要涉及癌癥途徑、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路和HIF-1信號通路等，推測覆盆子是通過調節這些通路治療2型糖尿病的。見圖6～9。

圖6 覆盆子治療2型糖尿病的生物過程氣泡圖

圖7 覆盆子治療2型糖尿病的細胞組分氣泡圖

圖8 覆盆子治療2型糖尿病的分子功能氣泡圖

圖9 覆盆子治療2型糖尿病的KGGG通路氣泡圖

2.5 “成分-靶點-通路”網絡的構建

將富集分析得到KEGG通路對應覆盆子治療2型糖尿病的靶點及成分，構建“成分-靶點-信號通路”網絡，此網絡由168個節點和694條邊構成，其中圓形代表活性成分，菱形代表關鍵靶點，倒三角代表信號通路。根據網絡的拓撲學性質，對網絡進行度值評價，根據度值、介度、緊密度確定關鍵節點。其中度值較高的成分有槲皮素(126)、山奈酚(52)、甾谷醇(29)、鞣花酸(17)。度值較高的通路有Pathways in cancer(60)、TNF信號通路(49)、MAPK信號通路(47)、AGE-RAGE信號通路(37)。

結果顯示覆盆子每種活性成分對應多個靶點，每個靶點連接多種成分，體現了“多成分、多靶點”的作用機制，同時，多條通路之間是通過共有靶點連接而非獨立分開的，表明各條通路之間可發揮協同作用起到治療作用。見圖10。

圖10 覆盆子治療2型糖尿病的“成分-靶點-通路”網絡圖

2.6 分子對接

選取PPI網絡中度值排名前7的靶點蛋白，即Akt1、IL6、TP53、TNF、VEGFA、MAPK1和JUN與“藥物-活性成分-靶點”網絡中度值排名前5的活性成分：槲皮素、山奈酚、甾谷醇、鞣花酸和兒茶素。利用AutoDock Tools進行分子對接，結果見表2。對接分數的絕對值越大，化合物與靶點結和力越強，分子構象越穩定，結果顯示槲皮素、山奈酚與TP53的親和力最強，鞣花酸、兒茶素與TNF的結合能力最強，甾谷醇與VEGFA的結合能力最強。其中親和力較強的分子對接圖見圖11。可以觀察到藥物活性成分與靶點蛋白相結合的具體位點，黃色連線為二者之間的氫鍵相互作用力，是促使分子結合到活性位點的主要作用力。

表2 覆盆子治療T2DM核心成分與靶點的分子對接結果

圖11 覆盆子治療2型糖尿病核心成分與靶點分子對接圖

3 討論

本研究前期分別對提取溶劑(水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇)以及提取方法(超聲、回流)進行了考察，以篩選最佳提取方法。結果表明采用70%甲醇回流提取時，各分析物響應最好，提取率最高，提取效果最優。在優化色譜條件時，本研究重點比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水和乙腈(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸水分別作為流動相時的色譜行為，結果表明采用甲醇-0.1%甲酸水溶液做流動相時的色譜峰較多且分離度較好。

本研究通過液質聯用技術鑒定出覆盆子36種成分，其中黃酮類成分16個，鞣質類成分12個，酚酸類成分8個，并通過數據庫篩選出槲皮素、山奈酚、甾谷醇和鞣花酸等8個活性成分。研究發現槲皮素通過上調大鼠胰島細胞瘤細胞活性，促進胰島素的分泌[10]。此外，槲皮素還可改善高糖引起的細胞損傷，改善糖尿病大鼠的糖代謝水平，保護大鼠胰島細胞瘤細胞免受高糖損傷。山奈酚可以與α-葡萄糖苷酶直接結合，表現出酶抑制效應，降低體內血糖含量[11]。鞣花酸[12]可顯著改善糖尿病小鼠脂肪組織異常的胰島素信號，降低脂肪組織Beclin1和LC3II/I蛋白表達。

KEGG信號通路富集分析發現覆盆子治療2型糖尿病的主要信號通路有癌癥途徑、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路和HIF-1信號通路等。癌癥途徑主要與癌癥疾病相關，與該通路相關的靶基因有61個，這提示2型糖尿病與癌癥存在某些共同的靶基因。研究發現，AGEs-RAGE是糖尿病各種并發癥發生發展主要原因之一，當機體糖尿病應激狀態時，RAGE出現異常高表達，激活下游NF-κB等轉錄因子高表達，引發炎癥反應，使IL-6及TNF-α等炎癥因子大量釋放，出現組織細胞的功能障礙和結構損傷，引起各種病理變化，從而參與糖尿病多種并發癥的發生發展[13-14]。HIF-1信號通路是機體低氧應激反應時的主要靶點,研究表明，抑制HIF-1α表達能降低糖尿病小鼠的血糖水平[15]。TNF-α是一類重要炎性遞質，與胰島素抵抗有密切關系，TNF-α可干擾胰島素信號的轉導通路進而導致機體發生胰島素抵抗[16-17]。

綜上，本研究通過UPLC-Q-Orbitrap-MS技術結合網絡藥理學方法，對覆盆子的化學成分進行解析并對其治療2型糖尿病的作用機制進行預測分析，建立了覆盆子“成分-疾病-通路”的生物學網絡，并從多個角度探索覆盆子治療2型糖尿病的潛在分子機制，為覆盆子后續的藥效物質基礎以及作用機制研究提供了參考。