葛根芩連湯抑制特應性皮炎小鼠模型炎癥反應及恢復皮膚屏障功能的實驗研究

李昱達 鄭豐杰 王航 張淑靜 馮婧 劉錦鋼 湯陽 孫燕 李宇航

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)，又稱特應性濕疹，屬中醫“四彎風”“奶癬”“胎瘡”等范疇，其發病與先天稟賦不足、胎毒遺熱、脾虛失運，風、濕、熱邪蘊結肌膚有關，具有表里同病、虛實夾雜的病證特點[1-2]。

近年來，對腸道與皮膚相互作用對過敏性疾病發病機制認識的日益增加，為治療AD提供了新的思路與途徑[3]，如發現腸道菌群可通過調節免疫系統影響AD的發生發展，使用益生菌影響腸道菌群的組成對AD具有積極影響[4]。《傷寒論》葛根芩連湯具有外解表熱、內清濕熱之功，為表里雙解之劑。現今臨床應用葛根芩連湯辨證治療潰瘍性結腸炎、2型糖尿病等為研究熱點，其作用機制與炎癥因子、腸道菌群、脂聯素相關信號通路等相關[5]。本文旨在觀察葛根芩連湯對2,4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene,DNFB)反復刺激皮膚誘導致敏的小鼠模型的干預作用，并從改善皮膚屏障功能和調控免疫炎癥角度初步探討其效應機制，以期為中醫臨床辨證治療AD提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24只SPF級BALB/c小鼠，6周齡，體質量(20±2)g，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SYXK(北京)2016-0006。適應性飼養7天，自由飲水和進食。所有實驗程序和實驗動物使用均符合北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會規定，倫理批準號：BUCM-4-2021051701-2061。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器

葛根芩連湯由葛根24 g、炙甘草6 g、黃芩9 g、黃連9 g組成[6]，中藥材全部購自北京同仁堂藥店。常規煎煮后，80℃水浴濃縮為濃度為1 g生藥/mL的藥液，4℃冰箱儲存備用?？匪崮姿赡z[規格：0.1%，華潤三九(南昌)藥業有限公司，批號：2006007J]。

DNFB(美國Sigma公司，批號:M24318031)，丙酮(北京化工廠，批號：20170209)，橄欖油(西班牙 Mueloliva公司，貨號：fTYKZEeC)，脫毛膏(英國 Dimples公司，批號：20210621)，二甲苯(天津市凱通化學試劑有限公司，批號：20190325)，無水乙醇(北京化工廠，批號：20200417)，蘇木素染色液(中杉金橋，批號：20042002)，伊紅染色液(中杉金橋，批號：20060901)；小鼠血清總免疫球蛋白E (immunoglobulin E，IgE)酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa)試劑盒(批號:KT2056-A)，小鼠血清白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)Elisa試劑盒(批號:KT2163-A)，小鼠血清白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)含量Elisa試劑盒(批號:KT2176-A)，均購自江蘇科特生物科技有限公司。細胞組織RNA 提取試劑盒(Qiagen 批號: 74134)；反轉錄試劑盒(Thermo ，批號:K1622)；DNase/RNase-Free 水(索萊寶， 批號:R1600);Power SYBR Green PCR Master Mix熒光定量試劑盒(ABI，批號: 4367659)；高透光度粘性蓋膜 (ABI，批號:4360954)；MicroAmp?Fast96孔反應板(ABI，批號: 4346906)；RNA引物(上海英俊生物技術有限公司)；普通 RIPA裂解液(索萊寶，批號:R0020)；蛋白酶抑制劑混合液(索萊寶，批號:P6730)； Filaggrin antibody(Proteintech公司，批號: 0900096)、密封蛋白1 antibody (Bioss公司，批號:AI100918); β-actin antibody(Bioss公司，批號:AH1 1286487)；HRP標記羊抗兔(Bioss公司，批號:AI100918)。

獨立通氣籠IVC飼養籠(江蘇·蘇杭科技器材有限公司)，皮膚多探頭測試儀(德國Courage+Khazakz)；HistoCore全自動封閉式組織脫水機，HistoCore Arcadia H石蠟包埋機，HistoCore Arcadia C組織切片冷臺，RM2255全自動切片機，HI1210攤片機和HI1220烤片機均購自德國Leica公司。Revolve FL正倒置一體熒光顯微鏡(美國Echo公司)，酶標儀(美國Biorad公司)，冷凍高通量組織研磨機(恩茨生物技術公司)，電泳儀器(Bio-Rad公司)，雙垂直電泳槽(Bio-Rad公司)，超靈敏多功能成像儀(Azure生物系統公司)，PCR擴增儀(Biorad公司)，StepOnePlus實時熒光定量 PCR儀(ABI公司)。

1.3 分組與造模

采用隨機數字表法將24只雄性BALB/c小鼠分為正常組、模型組、對照組(糠酸莫米松治療)和中藥組(葛根芩連湯治療)。參照文獻[7]采用DNFB半抗原反復刺激的方法制備AD小鼠模型。具體方法如下(見圖1)：致敏前用電推剪和脫毛膏除去小鼠背部毛發，面積約2.0 cm × 3.0 cm。在1 cm×1 cm的紗布上滴涂2% 的DNFB溶液200 μL，均勻涂抹在背部皮膚，每周2次(即第1、4、8、11天)。14天后改用0.2%的DNFB溶液200 μL，均勻涂抹在背部皮膚，2次/周，第15、18天重復上述操作，持續1周，模型組和各藥物治療組給予上述處理；正常組小鼠在相應時間點在背部涂抹等量基質溶液(丙酮∶橄欖油=4∶1)。

圖1 小鼠AD模型制備流程

1.4 藥物干預方法

在實驗第22天開始給藥。中藥組用葛根芩連湯灌胃6.24 g/(kg·d)，每日兩次，連續7天；對照組于小鼠皮損處均勻涂抹適量0.1% 糠酸莫米松凝膠，每日一次，連續7天；同時，正常組和模型組給予等量常溫蒸餾水灌胃，每日兩次，連續7天。

1.5 取材方法

于實驗第29天，對各組小鼠進行10 %水合氯醛麻醉后，采用摘眼球取血法獲得小鼠全血0.5～1 mL，室溫靜置2小時后，使用4℃離心機，高速離心15分鐘，3 000 r/min，抽取血清后置于冰箱保存待測。無菌條件下取小鼠皮損處皮膚組織，取部分皮膚以提取組織蛋白及RNA，其他皮膚組織以4%多聚甲醛溶液固定保存。

1.6 指標觀測

1.6.1 皮損評估 于實驗第1、7、14、28天，參考濕疹面積及嚴重程度指數(eczema area and severity index，EASI)[8]評價皮損情況與評估。背部皮損炎癥的評價指標:紅斑(出血)、水腫、表皮剝脫、鱗屑。0：無癥狀；1：輕；2：中；3：重。最高為12分。

1.6.2 小鼠搔抓行為觀察 觀察小鼠一般情況，參照Kuraishi方法[9]，在實驗第1、7、21、28天對小鼠搔抓行為進行觀察，記錄小鼠前后肢對頭面部、腹部、背部的搔抓次數并進行統計。

1.6.3 經皮水分流失檢測 于實驗第1、7、21、28天對小鼠進行經皮失水數值測量。使用皮膚多探頭測試儀的Tewameter TM300探頭測定小鼠背部皮損處經皮失水率，使用標準測量法，設置測定時間為20秒/次，讀取前15秒的平均值。

1.6.4 皮膚pH值 于實驗第1、7、21、27天對小鼠進行皮膚pH值檢測。使用pH905探頭測定皮損及非皮損處 pH值，每次重復檢測3次，結果取平均值。保持每次檢測時間、室內環境、檢測人及其他條件的相對一致性。

1.6.5 皮膚組織病理學 取小鼠剃毛區域皮膚組織，用4%多聚甲醛溶液固定后，將組織標本脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色，顯微鏡下觀察組織病理改變。

1.6.6 血清總IgE、IL-6、IL-10水平檢測 使用ELISA試劑盒進行血清相關指標檢測，具體步驟參考試劑盒說明書進行。反應結束后，使用酶標儀在450 nm測量96孔板中各孔樣本的吸光值(OD值)，根據標準曲線，計算樣本濃度。

1.6.7 絲聚合蛋白、密封蛋白1 mRNA表達 在皮膚組織中加入適量的裂解液和研磨珠，放入冷卻組織研磨機粉碎，用RNA提取試劑盒取組織上清液，測定濃度并逆轉錄為cDNA。將 GAPDH 作為內參，SYBR Green 作為染料進行熒光定量 PCR 擴增。反應體系為20 μL，反應條件為：95 ℃預變性10 分鐘； 95 ℃變性5秒，60 ℃退火30秒，40個擴增循環；熔解曲線放大，95℃ 15秒，60℃ 1分鐘；在 95 ℃下延長15秒。通過計算2-ΔΔCt法進行相對表達量分析。引物序列見表1。每組隨機取3只小鼠的皮膚組織進行檢測。

表1 引物序列

1.6.8 絲聚合蛋白、密封蛋白1的蛋白表達 在皮膚組織中加入適量的含有苯甲磺酰氟的組織裂解液和研磨珠，放入組織研磨機粉碎，離心提取組織上清液并通過變性buffer使其變性。SDS-PAGE電泳分離蛋白質，并進行恒壓轉膜，5%脫脂奶粉封閉，孵育一抗過夜、TBST洗3次，孵育二抗，TBST洗3次，顯色、拍照。運用Image J軟件分析灰度值，并計算與目標蛋白灰度值/β-actin灰度值的相對表達。每組隨機取3只小鼠的皮膚組織進行檢測。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 小鼠皮損評估

用2%DNFB丙酮、橄欖油溶液刺激后，小鼠情緒躁動不安，頻繁搔抓背部，背部皮膚出現輕微紅斑、水腫、小面積表面剝脫等表現。 隨著涂抹次數的增加, 出現紅斑加重、皮膚結痂并伴有干燥、脫屑、皮膚肥厚增生等慢性改變。給藥后，與模型組比較, 中藥組、對照組小鼠背部皮損的紅斑、結痂逐漸消退，皮膚肥厚增生較少。

造模第1、7、21天，與正常組相比，模型組皮損程度嚴重(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組皮損程度無明顯差異(P>0.05)。第28天，與正常組相比，模型組皮損程度嚴重(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組皮損顯著改善(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 各組AD小鼠皮損嚴重程度評分比較分)

注：A 正常組；B 模型組；C 中藥組；D 對照組。

2.2 搔抓行為觀察

在各組小鼠造模的第1天，觀察其30分鐘內搔抓次數。與正常組比較，模型組搔抓次數明顯增高(P<0.05)；與模型組相比較，中藥組、對照組搔抓次數無明顯差異(P>0.05)。造模的第7、21天，觀察其30分鐘內搔抓次數，與正常組比較，模型組搔抓次數明顯增高(P<0.05)；與模型組相比較，中藥組、對照組搔抓次數無明顯差異(P>0.05)。造模第28天觀察其30分鐘內搔抓次數，與正常組比較，模型組搔抓次數明顯增高(P<0.05)；與模型組相比較，中藥組、對照組搔抓次數有明顯減少(P<0.05)。見表3。

表3 各組AD小鼠30分鐘內搔抓次數比較次)

2.3 經皮水分流失分析

造模第1天，與正常組相比，模型組經皮失水升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組無明顯差異(P>0.05)。第7、14、21天，與正常組相比，模型組經皮失水顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組無明顯差異(P>0.05)。第28天，與正常組相比，模型組經皮失水升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組經皮失水明顯下降(P<0.05)。見表4。

表4 各組AD小鼠經皮失水比較

2.4 皮膚pH值

造模第1、7、21天，與正常組相比，模型組皮膚pH值顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組皮膚pH值無明顯差異(P>0.05)；第27天，與正常組相比，模型組皮膚pH值顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組皮膚pH值明顯下降(P<0.05)。見表5。

表5 各組AD小鼠皮膚pH值比較

2.5 皮膚組織病理學觀察

治療后，正常組表皮及真皮各層結構完整且正常;模型組表皮層不完全角化，顆粒層和棘層增厚，表皮、真皮層均有大量炎細胞浸潤;中藥組及對照組小鼠表皮層角化不全嚴重程度較輕，顆粒層、棘層輕微增厚，中等量炎細胞浸潤。見圖3。

注：A 正常組；B 模型組；C 中藥組；D 對照組。

2.6 血清總IgE、IL-6、IL-10

血清總IgE水平:與正常組相比，模型組數值較高，存在顯著差異(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組IgE數值均明顯降低(P<0.05)。血清IL-6水平:與正常組相比，模型組數值較高，存在顯著差異(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組IL-6數值均明顯降低(P<0.05)。血清IL-10:與正常組相比，模型組明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，中藥組與對照組無顯著差異(P>0.05)。見表6。

表6 各組AD小鼠血清總IgE、IL-6、IL-10水平比較

2.7 皮膚組織絲聚合蛋白、密封蛋白1 mRNA表達

與正常組相比，模型組絲聚合蛋白的mRNA表達顯著降低(P<0.05)，密封蛋白1的mRNA表達明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，中藥組與對照組各指標mRNA表達均明顯升高(P<0.05)。結果見表7。

表7 各組AD小鼠皮膚組織絲聚合蛋白、密封蛋白1 mRNA表達情況

2.8 皮膚組織絲聚合蛋白、密封蛋白1蛋白表達

與正常組相比， 模型組絲聚合蛋白的蛋白含量顯著降低(P<0.05)，密封蛋白1的蛋白含量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，中藥組與對照組各指標蛋白含量均明顯升高(P<0.05)。結果見表8，圖4。

表8 各組AD小鼠皮膚組織絲聚合蛋白、密封蛋白1 蛋白表達情況

注：A 正常組；B 模型組；C 中藥組；D 對照組。

3 討論

AD確切病因及發病機制尚未完全闡明，目前占主導地位的是美國學者Peter M. Elias提出的“內外串擾病機學說”，即AD發生發展是在皮膚屏障功能受損基礎上，變應原引發免疫功能紊亂和調節失衡，導致過敏性炎癥反應；而異常免疫炎癥反應進一步破壞皮膚屏障。內外串擾，形成惡性循環，導致本病遷延難愈[10-11]。現今臨床治療AD，主張改變生活習慣、避免接觸過敏原、外用保濕潤膚劑等基礎治療，輕中度患者可局部外用糖皮質激素、鈣調神經磷酸酶抑制劑、磷酸二酯酶4等緩解或消除癥狀，重度患者口服抗組胺藥物、免疫抑制劑、系統應用糖皮質激素等[12]；尋找和研究治療AD作用確切、副作用低的有效方藥或成分，一直是皮膚科學領域的研究熱點。

AD屬于中醫學“奶癬”“胎斂瘡”“四彎風”“血風瘡”“浸淫瘡”等病證范疇，中醫學對其病因病機的認識和治療積累了豐富經驗，中醫中藥或中西醫結合辨證治療AD安全有效，且具有不易復發、不良反應發生率低等優勢[13-15]。世界中醫藥聯合會皮膚科專業委員會2021年發布的特應性皮炎中醫診療指南中[1]，將AD分為心脾積熱、心火脾虛、脾虛濕蘊、風濕熱蘊、脾虛血燥、脾腎陽虛6個證型辨證施治，并提出AD急性期治療當以祛除蘊結在肌膚之風濕熱邪為要，輔以健脾祛濕，推薦選用三心導赤飲、培土清心方、小兒化濕湯、消風散等加減，側重從心、脾兩臟論治。有學者提出基于“肺主皮毛”理論，運用宣、補、潤、清等法從肺論治AD[16]。本課題組采用經方麻黃連軺赤小豆湯加減辨治AD證屬風濕熱邪蘊結肌膚者，臨床療效滿意，并從調控非組胺依賴性神經信號傳導、皮膚屏障功能等方面探討了其效應機制[17-19]。

“皮應大腸”是中醫學藏象學說代表性理論之一。對此，《靈樞·本藏》云：“大腸者，皮其應”“皮厚者，大腸厚，皮薄者，大腸??；皮緩，腹里大者，大腸大而長；皮急者，大腸急而短；皮滑者，大腸直；皮肉不相離者，大腸結”，強調了皮膚與大腸生理上相互聯系、病理上相互影響。多項臨床研究證實腸道疾病與皮膚病存在共病風險：2020年韓國一項基于全國人群的研究發現，患AD可導致克羅恩病與潰瘍性結腸炎患病風險增加[20]；2021年又一項前瞻性隊列研究表明，特應性皮炎、銀屑病和酒糟鼻患者克羅恩病的發病風險增加[21]。這些研究為中醫“皮應大腸”理論和皮膚病從腸論治提供了臨床證據和思路。

葛根芩連湯出自《傷寒論》，主治太陽病誤用攻下、里熱挾表邪下利證，是后世用以治協熱下利的代表方劑，現今臨床多用其治療腸炎、結腸炎等腸道炎癥證屬濕熱者。需要指出的是，《傷寒論》第34條原文中“下利”“脈促”“喘而汗出”不僅反映了里(腸、肺)熱挾表邪為病的特點，而且以主癥“下利”強調邪熱在“腸”，以兼癥“喘而汗出”提示邪熱在“肺”“皮毛”間攻沖串擾，故亦可用于治療呼吸、皮膚相關疾病。

經皮失水、皮膚pH值是檢測皮膚屏障的無創指標，兩者都可反映出皮膚屏障是否出現功能障礙。研究表明AD患者的經皮失水及皮膚pH值均有升高[22]。絲聚合蛋白參與表皮角質形成細胞的分化，對皮膚屏障的形成發揮關鍵作用。密封蛋白1是緊密連接的重要組成，其可維持皮膚屏障完整性。有實驗研究表明當密封蛋白1水平下降到閾值，會導致緊密連接和表皮屏障功能受損，并發生AD[23]。本課題研究表明，葛根芩連湯用于治療AD模型小鼠有較好療效，可有效緩解小鼠背部皮膚損傷情況，減少小鼠搔抓次數，降低經皮水分流失及皮膚pH值，抑制炎癥反應并可提高小鼠皮膚組織絲聚合蛋白、密封蛋白1含量從而改善皮膚屏障功能，為進一步深入探討葛根芩連湯從腸防治AD的相關機制奠定了實驗基礎。