一株羅布泊鹽湖鏈霉菌的鑒定及其代謝產物對酪氨酸酶活性、黑色素生成的抑制效應

王 俊，付建紅*，王玉苗，阮文偉，聶慧林，崔鳳真

1新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室；2新疆師范大學干旱區植物逆境生物學實驗室；3新疆師范大學生命科學學院，烏魯木齊830054

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，tyrosinase)又稱為多酚氧化酶，是動物、植物和微生物黑色素生物合成過程中的關鍵酶，其表達活性決定著黑色素生成的速度和數量[1,2]。酪氨酸酶抑制劑在化妝品、果蔬保鮮、生物農藥及黑色素代謝疾病的治療等方面，有著巨大的應用前景[3]。目前，酪氨酸酶抑制劑主要通過天然產物提取或化學合成得到。極端環境微生物在適應強酸、強堿、強輻射等其他生物無法生存的環境中形成了特殊的基因類型及生理機制，能夠產生結構新穎、生物活性顯著的次級代謝產物，這為酪氨酸酶抑制劑的篩選提供了新的思路[4]。本文的研究對象是一株分離自中國第二大咸水湖—新疆羅布泊的鏈霉菌89-2-2，經鑒定為西唐氏鏈霉菌(Streptomycessetonii)屬菌株。西唐氏鏈霉菌Z-L-22發酵可產生抑菌活性物質[5]。有人發現西唐氏鏈霉菌菌體及其產生的磷酸三酯酶可降解有機磷殺蟲劑[6]。目前，尚未見有關西唐氏鏈霉菌產生酪氨酸酶抑制劑和黑色素合成抑制劑的報道。本實驗對Streptomycessetonii89-2-2代謝產物抑制酪氨酸酶活性和抑制黑色素合成的活性進行研究，以深入挖掘極端環境微生物獨特的生物活性潛能，為開發在醫藥、化妝品等領域迫切需要的天然黑色素合成抑制劑及其先導化合物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

菌株89-2-2分離自新疆羅布泊鹽湖土壤。

1.1.2 培養基

R2A固體培養基：酵母浸出粉0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，酸水解干酪素0.5 g，蛋白胨0.5 g，葡萄糖0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g，K2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。菌株種子液培養基和液體發酵培養基與固體培養基相同，均不加瓊脂。

1.1.3 主要試劑和儀器

小鼠黑色素瘤B16細胞購自中科院上海細胞生物研究所，由本實驗室液氮凍存、培養和傳代；CCK-8(北京博奧森生物技術有限公司，批號：BA03175388)；RPMI-1640培養基(美國GIBCO公司，批號：8122013)、胎牛血清(美國GIBCO公司，批號：2176377)；L-多巴(美國Sigma公司，批號：#SLBR0479V)、蘑菇酪氨酸酶(比活力為5 340 U/mg，美國Sigma公司，批號：#SLCG8506)；胰蛋白酶(上海逍鵬生物科技有限公司，批號：J130056)；其他試劑均為分析純。恒溫培養振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司，中國)；SHELLAB全自動二氧化碳培養箱(上海力申科學儀器有限公司，中國)；旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠，中國)；超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設備有限公司，中國)；超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司，中國)；COIC倒置顯微鏡(北京汗盟紫星儀器儀表有限公司，中國)；SpectraMax多功能酶標儀(美國加州分子儀器公司，美國)；高速離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司，中國)；Hewlett-Packard紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司，中國)。

1.2 耐鹽性實驗

菌株89-2-2接種于鹽濃度分別為5%、10%、15%、20%(W/V)的R2A固體培養基中，30 ℃恒溫培養14天，每隔1～2天觀察菌體形態及生長狀況。

1.3 菌種鑒定

1.3.1 培養特征、細胞形態觀察及生理生化特性測定

參照《放線菌系統學》觀察菌株89-2-2的菌落和細胞形態，檢測該菌株的相關生理生化特性。使用API50CH試劑盒測定該菌株產酸酶學特性指標，GENⅢ鑒定板測定碳源利用指標[7,8]。

1.3.2 全細胞壁氨基酸的提取及分析

全細胞壁氨基酸的提取及分析均參照文獻[9]的標準操作進行，用薄層層析掃描法分析氨基酸組成。

1.3.3 16S rRNA基因型分析及其系統發育分析

采用Chelex-100法提取菌株89-2-2的基因組DNA，擴增16S rDNA并測定序列，將得到的序列利用Blast軟件在GenBank、EMBL及DDBJ等數據庫中進行相似性搜索，并與基因庫中已知菌株比較，確定菌株的初步分類地位。

1.4 菌株89-2-2代謝產物提取物的制備

將活化后的菌株89-2-2接種于R2A液體培養基中，30℃、180 r/min振蕩培養3～5天。按5%接種量將種子培養液接種到液體發酵培養基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養3～5天。6 000 r/min離心20 min，分別收集發酵上清液和菌體沉淀。上清液用乙酸乙酯萃取、蒸餾，最后用含5% DMSO的磷酸鹽緩沖液溶解，獲得上清液樣品。菌體用60%冷丙酮浸提過夜，再用超聲波破碎儀破碎細胞(功率200 W，破碎30 s，間歇30 s，破碎至菌液透明)，破碎液于4℃、6 000 r/min離心30 min，上清液用乙酸乙酯萃取后，分別收集乙酸乙酯相和丙酮水相，蒸餾后用含5% DMSO的磷酸鹽緩沖液溶解，獲得菌體乙酸乙酯相樣品和菌體丙酮水相樣品。

1.5 菌株89-2-2代謝產物的提取物對蘑菇酪氨酸酶二酚酶活性的影響

1.5.1 菌株代謝產物提取物對蘑菇酪氨酸酶二酚酶抑制率的測定

參考文獻[10]的方法測定菌株89-2-2代謝產物提取物對蘑菇酪氨酸酶二酚酶活性的抑制率。

1.5.2 菌株代謝產物提取物對蘑菇酪氨酸酶二酚酶IC50的測定

將菌株89-2-2上清液樣品凍干后得到的提取物溶于含5% DMSO的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度分別為0、0.125、0.250、0.375和0.500 mg/mL代謝產物的提取物溶液。菌株提取物對蘑菇酪氨酸酶二酚酶活性IC50的測定方法參照文獻[11]。

1.6 菌株89-2-2代謝產物提取物對黑色素瘤細胞的生物學效應

1.6.1 菌株89-2-2代謝產物提取物對黑色素瘤B16細胞增殖率的影響

取指數生長期的B16黑色素瘤細胞，調整細胞密度為5×104個/mL接種于96孔板，培養24 h左右待細胞完全貼壁后更換新培養基，每孔加入100 μL不同濃度提取物溶液(終質量濃度為100、250、500、750、1 000 μg/mL)，陽性對照熊果苷溶液(終質量濃度為31.25、62.25、125、250、500 μg/mL，DMSO體積分數為0.5%)，每個濃度設置3個復孔，空白組為新鮮培養液，對照組為加入新鮮培養液的單細胞懸液，培養24、48、72 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養箱中孵育4 h，用酶標儀測定各孔在450 nm下的吸光度。細胞(相對)增殖率按以下公式計算：

細胞增殖率=

(OD實驗-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%

1.6.2 菌株89-2-2代謝產物提取物對B16細胞酪氨酸酶活性的影響

細胞培養和藥物處理方法同“1.6.1”。藥物處理一定時間后，棄去上清，用PBS洗滌2次，每孔加入1%Triton 50 μL，迅速放入-80 ℃超低溫冰箱凍存30 min，隨后室溫融化使細胞完全破裂，酪氨酸酶釋放出細胞外，37 ℃預溫5 min后加入1%的L-DOPA溶液10 μL/孔，37 ℃反應1 h，在酶標儀490 nm處測其吸光度。酪氨酸酶(相對)活性按以下公式計算：

酪氨酸酶活性=OD實驗/OD對照×100%

1.6.3 菌株89-2-2代謝產物提取物對B16細胞黑色素合成量的影響

細胞培養和藥物處理同“1.6.1”。藥物處理一定時間后，棄去上清，用PBS清洗2次，消化并收集細胞，1 500 r/min離心10 min，棄去上清。加入2 mL的PBS重新懸浮，然后加入500 μL體積比為1∶1的乙醇/乙醚混合液，室溫下放置30 min，3 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入1 mL含10%DMSO的1.0 mol/LNaOH溶液完全溶解裂解細胞，80 ℃水浴2 h，測定其405 nm處吸光度。黑色素合成總量按以下公式計算：

黑色素合成總量=OD實驗/OD對照×100%

1.7 菌株89-2-2代謝物的LC-MS檢測分析

采用甲醇∶乙腈=1∶1對菌株培養物進行淬滅，其中含有同位素標記的內標混合物。渦旋混勻30 s后，35 Hz均質4 min，冰水浴超聲5 min。均質及超聲循環重復3次。然后-40 ℃孵育1 h，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。將上清液轉移至新的EP管中，真空干燥。加入200 μL 50%乙腈復溶，渦旋30 s，冰水浴超聲10 min；4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取75 μL上清液于進樣瓶中進行LC-MS檢測分析[12]。

使用Vanquish超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide液相色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)對目標化合物進行分離。液相色譜A相為水相，含25 mmol/L氨水和25 mmol/L乙酸銨；B相為乙腈。采用乙腈水梯度洗脫體系，流動相流速為0.5 mL/min，柱溫為25 ℃，樣品盤溫度為4 ℃，進樣體積正離子和負離子均為3 μL。使用高分辨質譜(Triple TOF 6600)，通過IDA(Information-Dependent Acquisition)模式進行質譜數據采集。本部分檢測委托上海阿趣生物科技有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 耐鹽性實驗

通過將菌株89-2-2接種于不同鹽(NaCl)濃度的R2A固體培養基中，觀察菌株的生長情況，菌株生長情況由強到弱分別用“+++”“++”“+”表示、不生長用“-”表示。經過各鹽濃度下菌株生長情況的觀察，確定菌株89-2-2的最適鹽濃度為5%，屬于中度嗜鹽鏈霉菌。

2.2 菌株89-2-2的鑒定

2.2.1 形態學、生理生化鑒定及全細胞壁氨基酸的分析

將菌株89-2-2接種到8種培養基中(ISP2/ISP3/ISP4/ISP5/PDA/TSA/察氏瓊脂/營養瓊脂)，分別培養4、7、10、14天后，記錄菌株的培養特征。菌株89-2-2在ISP4培養基上生長良好；在ISP4培養基上氣生菌絲較發達呈灰黃色，基內菌絲棕黃色，無可溶性色素產生。在ISP4固體培養基上，28 ℃下培養4天，菌落背面呈棕黃色，正面呈白色，圓形，表面有褶皺，最大菌落直徑約為2.5 mm(見圖1)。光學顯微鏡下觀察基內菌絲生長都比較豐富，分支不斷裂，氣生菌絲生長豐富，有分支，成熟的氣生菌絲分化形成孢子絲，孢子絲為直或波曲形，培養4天左右，孢子絲斷裂生成柱狀孢子(見圖2)。

采用API 50CH試劑條對菌株89-2-2進行生理生化檢測，結果顯示該菌株七葉靈為陽性；采用GENⅢ鑒定板檢測唯一碳源利用特性，結果顯示該菌株可將α-D-葡萄糖、D-果糖、D-麥芽糖等作為唯一碳源，不能利用L-海藻糖、蔗糖等；89-2-2菌株能夠使淀粉水解，牛奶凝固和胨化，硝酸鹽還原反應為弱陽性，明膠液化為陽性，結果見表1。

圖1 S. setonii 89-2-2在ISP4固體培養基中培養4天的菌落形態Fig.1 Colony morphology of S. setonii 89-2-2 was cultured in ISP4 solid medium for 4 days

圖2 光鏡下S. setonii 89-2-2的菌絲形態Fig.2 Mycelial morphology of S. setonii 89-2-2 under light microscope

菌株89-2-2的細胞壁含有丙氨酸(alanine，Ala)、甘氨酸(glycine，Gly)、谷氨酸(glutamic acid，Glu)、天冬氨酸(aspartic acid，Asp)、左旋-2,6-二氨基庚二酸(LL-2,6-diaminopimelic acid，LL-DAP)、內消旋-2,6-二氨基庚二酸(meso-2,6-diaminopimelic acid，Meso-DAP)、右旋-2,6-二氨基庚二酸(DD-2,6-diaminopimelic acid，DD-DAP)(見圖3)。

表1 S. setonii 89-2-2的生理生化特征

圖3 全細胞水解液氨基酸層析圖譜Fig.3 Amino acid chromatogram of whole cell hydrolyzate

2.2.2 菌株89-2-2的16S rRNA基因序列分析

菌株89-2-2的16SrRNA基因特異序列為1 411bp(GenBank登錄號為OK255534)，利用MEGA 5.0軟件，以NeighborJoining法構建菌株的系統發育樹(見圖4)。結果表明，菌株89-2-2和StreptomycessetoniiNBRCT13085T以及StreptomycesanulatusNRRL

圖4 S. setonii 89-2-2基于16S rRNA基因序列構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of S. setonii 89-2-2 based on 16S rRNA gene sequence

B-2000T的序列相似性最高，均為99.9%。結合菌株的形態特征和生理生化特性測定結果，可初步確定菌株89-2-2為西唐氏鏈霉菌(Streptomycessetonii)，并命名為Streptomycessetonii89-2-2。

2.3 菌株89-2-2代謝產物的提取物對蘑菇酪氨酸酶二酚酶活性的影響

制備Streptomycessetonii89-2-2代謝產物的丙酮提取物，用乙酸乙酯萃取后獲得的3個樣品參照文獻[10]的方法測定它們對蘑菇酪氨酸酶二酚酶活性的抑制率。結果表明，S.setonii89-2-2的上清液乙酸乙酯萃取相酶活性抑制率最高為72.2%，其次是菌體乙酸乙酯相和菌體丙酮水相的酶活性抑制率分別為44.9%和31.4%(見圖5)。

圖5 S. setonii 89-2-2代謝產物提取物對蘑菇酪氨酸酶的抑制活性Fig.5 S. setonii 89-2-2 inhibitory activity of metabolite extracts on mushroom tyrosinase注：A.空白；B.曲酸；C.上清液乙酸乙酯萃取相；D.菌體乙酸乙酯相；E.菌體丙酮水相。與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:A.Blank;B.Kojic acid;C.The ethyl acetate extract of S. setonii 89-2-2 supernatant;D.The ethyl acetate extract of S. setonii 89-2-2 precipitation;E.The acetone aqueous fraction of S. setonii 89-2-2 precipitation.*P<0.05,**P<0.01 vs blank.

在以L-DOPA為底物的酶活性測定體系中，加入不同濃度的菌株89-2-2上清液提取物溶液，以不加提取物為對照，測定相對酶活力，結果見圖6。由圖6可知，S.setonii89-2-2上清液提取物對蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力有較強的抑制作用，IC50為0.478

圖6 S. setonii 89-2-2提取物對酪氨酸酶二酚酶活力的影響Fig.6 Effect of S. setonii 89-2-2 extract on tyrosinase diphenolase activity

mg/mL，隨著提取物濃度增大，相對酶活力呈指數下降。

2.4 菌株89-2-2代謝產物的提取物對黑色素瘤細胞的生物學效應

2.4.1 菌株89-2-2提取物對小鼠黑色素瘤B16細胞增殖的影響

Streptomycessetonii89-2-2上清液提取物在100～1 000 μg/mL濃度范圍內作用細胞48～72 h，對黑色素瘤B16細胞生長幾乎沒有抑制作用，如圖7所示。濃度為1 000 μg/mL的S.setonii89-2-2提取物作用細胞后，細胞培養72 h活力仍能達到(120.1±0.26)%，陽性對照熊果苷在31.25～500 μg/mL濃度范圍內作用黑色素瘤B16細胞，細胞培養72 h后存活率也比較高，與S.setonii89-2-2提取物相比差異不顯著(P> 0.05)。

圖7 S. setonii 89-2-2提取物對B16細胞增殖率的影響Fig.7 Effect of S. setonii 89-2-2 extract on the proliferation rate of B16 cells

2.4.2 菌株89-2-2提取物對黑色素瘤B16細胞內酪氨酸酶活性的影響

與空白組相比，S.setonii89-2-2提取物在作用24、48、72 h后對黑色素瘤B16細胞內酪氨酸酶的總活性均具有抑制作用(見圖8)。用750 μg /mL和1 000 μg /mLS.setonii89-2-2提取物處理細胞，培養48 h后細胞內酪氨酸酶活性分別下降至(53.98±3.05)%和(51.92±0.38)%，抑制效果強于500 μg /mL熊果苷(實驗數據未給出)。隨著細胞培養時間的延長，750 μg/mLS.setonii89-2-2提取物持續地使細胞內酪氨酸酶相對活性降低，細胞培養72 h后酪氨酸酶活性與24 h相比具有顯著性差異(P<0.05)。陽性對照熊果苷作用細胞72 h后，隨著其濃度的增大和時間的延長細胞內酪氨酸活性反而逐漸增強，其原因可能是熊果苷易降解、抑酶活性不穩定，或者高濃度熊果苷在體外可提高小鼠黑色素瘤細胞的增殖率，促進細胞大量分泌酪氨酸酶，從而增強酪氨酸酶的活性[13]。

圖8 S. setonii 89-2-2提取物對B16細胞內酪氨酸酶活性的影響Fig.8 Effect of S. setonii 89-2-2 extract on tyrosinase activity in B16 cells

2.4.3 菌株89-2-2提取物對小鼠B16細胞內黑色素合成的影響

如表2所示，用濃度分別為100、500和1 000 μg/mL的S.setonii89-2-2提取物處理B16細胞，培養48 h后細胞內黑色素含量分別下降至(57.01±0.8)%、(76.28±2.90)%和(69.59±0.47)%，且不同濃度處理組之間的差異達到顯著性水平(P<0.05)。表明100、500和1 000 μg/mLS.setonii89-2-2提取物對B16細胞內黑色素合成具有顯著的抑制作用。

2.5 菌株89-2-2代謝物的UPLC-QTOF-MS檢測分析

前期我們優化了S.setonii89-2-2產生酪氨酸酶抑制劑的發酵條件，預實驗選取菌株89-2-2優化前和優化后的2個發酵條件的12個實驗樣本和3個質控(quality control，QC)樣本。實驗樣本和QC樣本的預實驗結果表明，樣本品質良好，實驗方法和儀器平臺良好。正式檢測實驗中菌株89-2-2發酵條件優化前后的兩組菌體細胞內代謝產物經提取、衍生化，上機檢測共得到5 338個峰(見圖9)。根據化合物的質荷比、保留時間和保留指數等對化合物進行鑒定，最終推測鑒定化合物626個，主要包括維生素類化合物、芳香類化合物、羧酸類化合物及氨基酸類化合物等。

表2 S. setonii 89-2-2提取物對黑色素瘤B16細胞內黑色素含量的影響

2.6 菌株89-2-2發酵條件優化前后差異代謝物的篩選與分析

采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP值(閾值>1)，并結合Student’st檢驗的P值(閾值<0.05)共篩選出28個差異代謝物，發酵條件優化后S.setonii89-2-2中上調差異代謝物有21個，下調差異代謝物有7個，優化前則相反。對上調差異代謝物的類別進行歸類分析發現，它們大多為維生素類化合物、芳香類化合物、羧酸類化合物等，其中維生素類差異代謝物有10個，芳香類差異代謝物有4個，羧酸類差異代謝物有9個，表3顯示S.setonii89-2-2發酵條件優化前后產生的部分差異代謝物。據文獻報道維生素類[14，15]、芳香類[16]和羧酸類[17]等小分子化合物對酪氨酸酶活性具有抑制作用。

圖9 實驗樣本UPLC-QTOF-MS總離子流圖Fig.9 Total ion chromatogram of UPLC-QTOF-MS of experimental samples

表3 S.setonii 89-2-2發酵條件優化前后產生的部分差異代謝物

3 結論

菌株89-2-2的最適鹽濃度為5%，屬于中度嗜鹽鏈霉菌。經形態特征、培養特征、生理生化特性、細胞壁化學組分及16S rRNA基因序列分析，初步鑒定菌株89-2-2為西唐氏鏈霉菌(Streptomycessetonii)。Streptomycessetonii89-2-2代謝產物的提取物對體外蘑菇酪氨酸酶二酚酶活性的IC50為0.478 mg/mL。在100～1 000 μg/mL濃度范圍內，菌株89-2-2提取物對小鼠黑色素瘤B16細胞的增殖沒有明顯的影響，但是可顯著抑制細胞內酪氨酸酶活性，有效地降低細胞內黑色素含量；1 000 μg/mL提取物作用B16細胞48 h可使細胞內酪氨酸酶活性下降48%，使黑色素含量降低31%。代謝組學的檢測結果顯示S.setonii89-2-2發酵條件優化前后產生的差異代謝物主要為維生素類化合物、芳香類化合物和羧酸類化合物，已有報道證明以上三類物質均具有抑制酪氨酸酶活性的能力?？梢?，S.setonii89-2-2是一種具有開發潛力的，可產生酪氨酸酶抑制劑和黑色素合成抑制劑的良好材料。