桂皮醛誘導人宮頸癌Siha細胞凋亡并下調HPV E6/E7蛋白表達

紫若·塔里哈提，曙麗盼·木拉提，張偉怡*，周文婷*

1新疆醫科大學藥學院；2新疆天然藥物活性組分與釋藥技術重點實驗室，烏魯木齊 830011

宮頸癌是婦女生殖系統中最常見的惡性腫瘤之一，超過99%的宮頸癌患者均伴有高危人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染，其中HPV 16和HPV 18作為常見的高危表型[1]。近年來，其發病率明顯升高，雖然藥物放/化療和手術治療對早期宮頸癌有一定療效，但對中晚期宮頸癌的治療效果欠佳，且復發率高，副作用明顯[2]。E6/E7作為宮頸癌中主要的致癌基因，是上皮細胞發生初始變化的原因，能夠促進宿主細胞增殖和病毒擴增[3]。研究表明，HPV E6/E7癌蛋白成為治療宮頸癌的潛在藥物靶點[4]。因此，誘導E6/E7降解的天然化合物可能是抗宮頸癌藥物的重要來源。

肉桂作為臨床上的常用中藥之一，具有“百藥之長”的稱號[5]。桂皮醛(cinnamaldehyde，CA)作為肉桂揮發油中的主要成分，是一種天然的小分子化合物[6]。研究表明，其具有解熱、抗炎及降糖等多種藥理活性，同時能夠抑制非小細胞肺癌、肝癌、胃癌以及黑色素瘤等多種腫瘤細胞增殖，呈現出一定的抗腫瘤作用[7-11]，但其誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制尚未完全闡明，關于其抗宮頸癌的作用也少見報道。本研究利用人宮頸癌Siha細胞，檢測CA在體外的抑癌效應及作用機制，為抗宮頸癌研究提供進一步的理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

人宮頸癌Siha細胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。桂皮醛(CA)、紫杉醇(TAX)、順鉑(Pt)以及5-氟尿嘧啶(5-FU)購自上海源葉生物科技有限公司(純度均≥ 98%)。CCK-8試劑盒(Lot No：BA08198147)、β-Actin、Bax、Bcl-2以及Survivin抗體購自北京bioss生物科技有限公司(純度均≥ 98%)；PAGE凝膠快速制備試劑盒(Lot No：20201230)、Hoechst 33342試劑盒(Lot No：20210623)、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(Lot No：20210512)以及細胞周期檢測試劑盒(Lot No：20201106)均購自北京索萊寶生物科技有限公司；細胞培養級別二甲基亞砜DMSO(Lot No：WXBD0293V)、DMEM高糖培養基(Lot No：2130206)以及胎牛血清FBS均購自美國Gibco公司；HPV E6及HPV E7購自美國Gene Tex公司；化學發光試劑盒(貨號：2021601)及PVDF膜(貨號：R1MB52546)均購自美國Millipore公司；HPR-goat anti rabbit抗體購自美國CST公司。

1.1.2 主要儀器

細胞培養箱、多功能酶標儀、高速低溫離心機以及垂直層流潔凈工作臺(美國Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；智能成像系統(上海Tanon公司)；蛋白電泳設備(美國伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

Siha細胞采用含10% FBS的不同培養基，37 ℃、5% CO2的細胞培養環境中培養細胞，根據細胞的生長情況約2～3天傳代一次。

1.2.2 CCK-8法測定細胞增殖

Siha細胞，以3.0×103個/孔鋪于96孔板內培養過夜。實驗組分別加入不同濃度的化合物，空白組加入雙蒸水(空白對照，藥品用DMSO配成母液后，通過雙蒸水進行稀釋)，對照組加入等倍稀釋的溶劑DMSO(溶劑對照)。每組設3個復孔，培養72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃作用2 h，用酶標儀于450 nm處測定OD值。并按下列公式分別計算不同化合物對多種細胞生長抑制率。

細胞增殖抑制率 =

(OD溶劑對照-OD給藥)/OD溶劑對照×100%

運用SPSS軟件，根據不同濃度化合物對細胞生長抑制率分別計算出其IC50。

1.2.3 細胞遷移實驗

在6孔板背面沿孔直徑均勻劃橫線。Siha細胞以2.0×105個/孔鋪于6孔板中培養過夜。用黃色吸頭垂直于橫線劃痕。去培養基，PBS清洗2～3次，加入不含血清的培養基。實驗組分別加入不同濃度的CA培養48 h，分別在劃痕0 h和48 h后觀察并拍照。使用Image J軟件進行統計分析。

1.2.4 細胞周期的流式細胞儀檢測

Siha細胞，以2.0×105個/孔鋪于6孔板中培養過夜。實驗組分別加入不同濃度的CA培養24 h。收集細胞樣品于流式管中，4 ℃，1 200 r/min離心5 min后，棄上清，加入1 mL PBS重懸后，再次按上述方法重復洗滌，棄上清。加入純度為95%的冷乙醇，混勻后置于4 ℃固定過夜。取上述固定細胞，4 ℃，1 200 r/min離心5 min后，去除乙醇后用PBS重懸，再次離心，重復此步驟兩次。每管分別加入400 μL RNaseA酶，置于37 ℃孵育30 min。隨后每管分別加入100 μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液，避光置于4 ℃孵育30 min后，上機進行流式檢測。最后采用Modfit軟件分析實驗結果。

1.2.5 Hoechst 33342熒光染色法鑒定凋亡細胞

Siha細胞以5.0×104/孔鋪于共聚焦小皿中培養過夜。實驗組分別加入不同濃度的CA培養24 h。棄去培養液，用4%多聚甲醛在4 ℃條件下固定15 min。棄固定液，Hoechst 33342染色液室溫條件下染色15 min。使用熒光顯微鏡觀測。

1.2.6 細胞中線粒體膜電位的檢測

Siha細胞以3.0×105/孔鋪于6孔板中培養過夜。實驗組分別加入不同濃度的CA，陽性對照組加入10 μmol/L 解偶聯劑(chloro carbonyl cyanide phenyl hydrazone，CCCP，能夠攜帶質子穿透線粒體內膜)，培養24 h。加入1 mL JC-1染色工作液，充分混勻，孵育20 min。隨后，用1×的JC-1染色緩沖液洗滌2次。再加入2 mL細胞培養液，于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.7 Western blot檢測

Siha細胞以3.0×105/孔鋪于6孔板中培養過夜。實驗組分別加入不同濃度的CA培養24 h。PBS清洗后，加入高效RIPA細胞裂解液，冰上裂解20 min，12 000 r/min離心15 min。分別收集上清，用BCA試劑盒進行蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉移至PVDF膜上，經5%脫脂牛奶封閉后，分別加入按相應比例稀釋后的一抗溶液(β-Actin、E6、E7、Bcl-2、Survivin及Bax)，4 ℃孵育過夜。經TBST室溫清洗3次，每次10 min。隨后加入1∶5 000稀釋的二抗溶液，室溫孵育1 h。經TBST充分清洗后，加入化學發光液進行曝光檢測。使用Image J軟件進行灰度統計分析。

1.2.8 藥物協同指數計算

利用CompuSyn軟件，可計算出兩種藥物之間共同作用的聯用指數(combination index，CI)。CI值>1，兩種化合物為拮抗；CI值=1，兩種化合物為相加；CI值<1，兩種化合物具為協同。

1.2.9 數據統計分析

2 實驗結果

2.1 CA抑制Siha細胞的增殖和遷移

首先對CA在不同時間、濃度下對Siha細胞的生長抑制作用分別進行檢測。結果如圖1A所示，CA呈時間、濃度依賴性地抑制Siha細胞的生長，且給藥后24、48和72 h的IC50分別為110.96、85.52、47.05 μmol/L，說明CA能夠抑制Siha細胞的增殖。

圖1 CA對Siha細胞增殖的抑制作用(n = 3)Fig.1 Inhibitory effect of CA on the proliferation in Siha cells (n = 3)

為了進一步驗證CA對Siha細胞生長的抑制作用，我們進行了細胞劃痕實驗。結果如圖2所示，與空白對照組(Ctrl)相比，隨著CA給藥濃度的升高，能夠明顯抑制Siha細胞的遷移，證實CA能夠有效抑制Siha細胞的遷移能力。

圖2 CA對Siha細胞遷移能力的影響(n = 3)Fig.2 Effect of CA on migration in Siha cells (n = 3)注：與Ctrl組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，下同。Note:Compared with Ctrl group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,the same below.

2.2 CA阻滯Siha細胞周期并誘導凋亡

目前常用的細胞周期檢測方法為PI染色，由于PI能夠嵌入到DNA雙鏈之間，從而被激光激發出紅色熒光，隨后再通過RNaseA酶孵育去除RNA。我們利用該方法，通過流式細胞術檢測CA對Siha細胞周期的影響，結果如圖3所示，與空白對照組(Ctrl)相比，隨CA濃度的升高，G2/M期的比例從21.62%上升至33.91%，并具有明顯的濃度依賴性，說明CA能夠阻滯在Siha細胞的G2/M期。

為了分析CA是否能夠誘導Siha細胞凋亡，我們首先通過Hoechst 33342染色觀察細胞凋亡情況。結果如圖4所示，CA處理后，細胞核呈現亮藍色熒光，且具有濃度依賴性，提示CA誘導Siha細胞凋亡。為了進一步驗證該結果，我們進行JC-1染色，通過熒光共聚焦顯微鏡觀察CA作用于Siha細胞后線粒體膜電位的變化情況。結果如圖5所示，與陽性對照組相比，隨CA濃度的升高，劑量組綠色熒光顯著增強，說明CA破壞了線粒體跨膜電位，誘導Siha細胞凋亡。

圖3 CA對Siha細胞周期的影響Fig.3 Effect of CA on cell cycle in Siha cells

圖4 CA對Siha細胞核染色質的形態學變化影響(標尺：50 μm)Fig.4 Effect of CA on the morphology of nuclear chromatin in Siha cells(scale:50 μm).

圖5 CA對Siha細胞中線粒體跨膜電位的影響(標尺：50 μm)Fig.5 Effect of CA on mitochondrial membrane potential in Siha cells (scale:50 μm)

此外，進一步通過Western blot法檢測了CA對Siha細胞中凋亡相關蛋白的影響。結果如圖6所示，通過灰度統計分析可以看出，抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin的表達減少，促凋亡蛋白Bax的表達增多。以上結果均進一步證明了CA可以誘導Siha細胞發生凋亡。

圖6 CA對Siha細胞凋亡的影響(n = 3)Fig.6 Effect of CA on apoptosis in Siha cells (n = 3)

2.3 CA通過蛋白酶體途徑抑制Siha細胞中HPV E6/E7的表達

考慮到HPV E6/E7在伴有HPV感染的癌細胞(如Siha)的生存中起著關鍵作用，我們進一步探究了CA對Siha細胞中E6/E7蛋白表達的影響。結果顯示，CA顯著降低了Siha細胞中E6/E7的表達水平，并呈現一定的濃度依賴性(見圖7)。

圖7 CA對Siha細胞中HPV E6/E7的影響(n = 3)Fig.7 Effect of CA on HPVE6/E7 in Siha cells (n = 3)

隨后，進一步探究CA抑制E6/E7表達的作用機制。預先加入一種蛋白酶體抑制劑MG132處理1 h，再加入CA共同作用6 h后檢測，結果如圖8所示，當MG132與CA共同作用后，E6/E7表達明顯增加，表明CA通過蛋白酶體途徑抑制E6/E7表達。

圖8 蛋白酶體抑制劑MG132對CA抑制Siha細胞中HPV E6/E7表達的影響(n = 3)Fig.8 Effect of proteasome inhibitor MG132 on the inhibition of CA on HPV E6/E7 expression in Siha cells (n = 3)注：與Ctrl組比較，**P<0.01，***P<0.001；與MG132 10 μmol/L組比較，#P<0.05；##P<0.01。Note:Compared with Ctrl group,**P<0.01,***P<0.001;Compared with MG132 10 μmol/L group,#P<0.05;##P<0.01.

2.4 CA與不同宮頸癌化療藥物聯用后具有協同效果

TAX、Pt以及5-FU均為治療宮頸癌的常用化療藥物，為了檢測CA是否能與這三種化療藥物產生協同效果，我們分別檢測了TAX、Pt、5-FU這三種藥物在Siha細胞中的抑制作用，并計算其IC50值。

首先對其單獨在Siha細胞中的活性進行檢測。結果如圖9A、9B、9C所示，給藥72 h后，其中TAX的IC50為16 μmol/L，Pt的IC50為36 μmol/L，5-FU的IC50為31 μmol/L。為了進一步檢測其與CA聯合在Siha細胞中是否有協同效果，我們根據其亞致死濃度，設定聯合給藥的濃度，并分別與CA進行聯合給藥考察抑制效果。通過計算IC50值發現，與單獨給藥組相比，TAX/Pt/5-FU分別與不同濃度的CA聯用后抑制作用明顯增強，且具有一定的濃度依賴性(圖9D、9E、9F)。隨后，將上述結果分別投入到聯合指數計算軟件中進行計算，發現TAX/Pt/5-FU與CA在一定濃度范圍內均具有協同效果(圖9G、9H、9I，協同指數見表1)。

圖9 三種宮頸癌化療藥物對Siha細胞的抗腫瘤效果及與CA的協同效果Fig.9 Anti-tumor effect of three cervical cancer chemotherapy drugs and synergistic effect with CA in Siha cells

表1 CA聯合三種宮頸癌化療藥物在Siha細胞中的協同指數

續表1(Continued Tab.1)

3 討論與結論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，常伴有高復發率和高轉移率的特點，嚴重威脅女性健康[12]。近年來，天然化合物通過抑制E6/E7，已廣泛探索其作為宮頸癌治療的潛在用途。例如，丹參酮IIA在轉錄水平抑制E6/E7，對宮頸癌細胞形成p53依賴的生長抑制[13]；茴香酸通過蛋白酶體降解在蛋白水平下調宮頸癌細胞中的E6/E7表達，并誘導p53非依賴性線粒體凋亡[14]；n-芐基肉桂酰胺通過抑制E6/E7 mRNA水平促進人宮頸癌細胞凋亡[15]。在本研究中，我們首次報道了CA能夠誘導Siha細胞凋亡并下調HPV E6/E7蛋白的表達水平。

細胞周期異常是腫瘤形成的主要原因之一，其調控機制包括細胞周期驅動和監控。當驅動機制受損時，會促使正常細胞生長失控，并向腫瘤細胞轉化；當監控機制受損時，會誘導細胞在DNA修復以及細胞死亡等環節發生功能紊亂，惡化整個調控機制[16,17]。我們通過流式細胞儀檢測發現，CA能夠誘導Siha細胞中G2/M期的細胞比例明顯增加，說明CA阻滯在G2/M期。細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種形式[18,19]，其過程主要涉及死亡受體信號通路、線粒體信號通路和內質網信號通路[20,21]。其中“線粒體信號通路”中的代表蛋白為Bcl-2及Bax等，它們在接收到胞內的死亡信號后激活，在線粒體外膜或胞漿中產生相互作用，從而引起線粒體膜通透性的改變、跨膜電位的丟失，進而釋放細胞色素C和其他蛋白[22]。前期實驗我們首先通過Hoechst 33342染色證實CA誘導Siha細胞凋亡；隨后通過JC-1熒光探針檢測，發現CA顯著降低Siha細胞中線粒體的跨膜電位；進一步的Western blot驗證發現CA使Siha細胞中的抗凋亡蛋白Bcl-2，survivin減少，促凋亡蛋白Bax增多，進一步說明細胞發生凋亡。E6/E7蛋白有助于維持伴有HPV感染的宮頸癌細胞的惡性表型，并且能夠調節許多與細胞存活、凋亡通路相關的分子。本文證明CA能夠下調E6/E7的表達水平，從而誘導伴有HPV感染的Siha細胞發生凋亡。隨后我們探究了CA誘導E6/E7降解的具體機制。結果證實用蛋白酶體抑制劑MG132預先作用后，能夠明顯減弱CA誘導的E6/E7降解現象，說明這兩個蛋白之前是由于蛋白酶體而發生降解。

小分子藥物對基因功能的影響都具有濃度依賴性[23]。如果一個小分子藥物能夠發揮抗腫瘤作用，它就可以采用亞致死濃度去篩選出能夠與其協同致死的藥物，這種方法被稱為化學基因組學篩選策略[24]。由于目前臨床上治療宮頸癌的化療藥物對患者具有一定的選擇性，且長期使用會出現耐藥性等副作用，而現有的臨床聯合給藥方案也僅對部分患者有效。因此，尋找并開發出新的治療藥物和聯合給藥的方案是我們需要進行的研究工作。在本研究中，我們利用化學基因組學篩選策略，對CA與臨床上常用的治療宮頸癌藥TAX、Pt、5-FU在Siha細胞中進行協同效果的檢測。結果證實，CA聯合上述化療藥物均能在一定濃度下呈現協同效果，且聯合用藥組的作用效果優于單獨用藥組，差異有統計學意義。據文獻報道，在抗腫瘤過程中，上述化療藥物均可引起DNA損傷，并阻滯細胞周期；其中，TAX可阻滯G2M期[25]；Pt可阻滯G2M期[26]；5-FU可阻滯G0/G1期[27]。根據本文研究結果，提示CA可能與上述化療藥物通過共同阻滯細胞周期，發揮協同增效的作用，進而誘導細胞凋亡，增強其抗宮頸癌效果。

綜上所述，本研究證實CA通過線粒體途徑誘導Siha細胞凋亡，并通過蛋白酶體途徑下調HPV E6/E7蛋白的表達；同時與多種宮頸癌常用化療藥物均能在細胞水平上呈現協同效果。以上研究為更好地治療宮頸癌提供了新的研究思路，同時也提出了新的聯合給藥方案，為減輕患者在抗宮頸癌治療中的耐藥性，提高對患者的有效率，提供了理論依據。