基于含量測定和指紋圖譜的遠志藥效物質累積規律研究

李建麗，李 慧，李慧峰，程艷剛，王佳敏，田洪嶺，王穎莉*

1山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，晉中 030619；2山西省農業科學院經濟作物研究所，汾陽 032200

藥效物質累積規律與藥材生長年份、采收時間有密切關系，二者對藥材本身的質量、療效有直接的影響，所以選擇合適的采收時間是保證藥材有效性的關鍵所在，對藥材藥效物質累積規律的研究可為其種植采收提供參考依據，可以保證藥效物質的含量，進而保證藥效。遠志的生長種植年份，多以3年生為主[9]，一般在種植滿兩年后的10月或第二年3、4月采收[10,11]。《中華人民共和國藥典》規定遠志在春、秋二季采挖，雖對采收期進行規定，但無生長年限要求。遠志野生資源匱乏，是國家三級野生保護植物，當前流通多為遠志栽培品。山西是遠志的道地產區，市面所售80%遠志產自山西。栽培資源主要集中于山西新絳、聞喜、洪洞等地[12]。

本研究利用定量和指紋圖譜法對遠志進行綜合考察，探討遠志不同產地、生長年份、采收時間與其藥材的長度、直徑、含水量、浸出物及含量測定等多方面累積規律的關系，以期對遠志藥材選種、種植、采收提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2998 PDA檢測器(沃特世科技有限公司)；Alltech ELSD 2000ES檢測器；Waters XSelect CSH C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)； SMART-NE純水儀(力康生物醫療科技控股有限公司)；KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-5298旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 材料

從山西汾陽、新絳采集了12批不同遠志藥材(采收時間分別為2021年春4月、秋10月)，經山西中醫藥大學裴香萍教授鑒定為遠志科植物遠志PolygalatenuifoliaWild.。原植物標本保存于山西中醫藥大學山西省現代中藥工程實驗室,其詳細信息見表1；PX Ⅲ對照品(批號：P27A11S122507，純度≥98%；上海源葉生物科技有限公司)；DISS對照品(批號：YZM2-XPU0；含量96.6%；中國食品藥品檢定研究院)；TEN對照品(批號：R23N8F49013；純度≥98%；上海源葉生物科技有限公司)；色譜級甲醇、乙腈(瑞典Oceanpak公司)。無水乙醇、正丁醇、甲醇、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

表1 遠志信息表

續表1(Continued Tab.1)

2 方法與結果

2.1 檢查

2.1.1 水分檢查

遠志采收后，除去附著泥沙，平鋪于地面，室溫通風陰干，2天后再次除去干燥泥沙，抽取木芯，繼續通風陰干遠志筒，至藥材干燥易折斷，收集得到待測遠志藥材。秋采與春采干燥方法和時間相同。按照2020版《中華人民共和國藥典》的通則0832熱烘法進行水分測定，計算藥材中含水量(%)，數據記錄見表2。

12批藥材含水量均小于12%，符合要求。新絳產6批藥材含水量均高于汾陽，各相同生長年份的汾陽產與新絳產藥材水分含量差異均有統計學意義(P<0.05)；兩地產春采與秋采藥材水分含量差異不明顯。

2.1.2 浸出物檢查

按照2020版《中華人民共和國藥典》的通則2201項下的熱浸法，用70%乙醇作溶劑，計算浸出物的含量(%)，數據記錄見表2。

表2 遠志藥材含水量、浸出物含量

12批遠志浸出物含量均大于2020版《中華人民共和國藥典》規定的30%。由圖1可知，汾陽產春采藥材浸出物含量隨著生長年份的增加而升高，趨勢明顯，新絳產春采藥材浸出物含量隨著生長年份的增加而降低，與汾陽產趨勢相反。兩地秋采藥材浸出物含量與生長年份均不具有明顯的增加或減少趨勢。兩地各生長年份、采收季節相同的藥材相比，新絳產浸出物含量較高。新絳秋采藥材浸出物含量低于春采。

2.2 遠志指標性成分的含量測定

2.2.1 溶液的制備

取PX Ⅲ、DISS對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含PX Ⅲ 0.15 mg、DISS 0.2 mg的混合對照品溶液；取TEN對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含TEN 1 mg的溶液，得對照品溶液。

圖1 遠志藥材浸出物含量變化Fig.1 Changes of extract content of Polygalae Radix注：左圖為汾陽產；右圖為新絳產。Note:Left:Fenyang production;Right:Xinjiang production.

PX Ⅲ、DISS和TEN供試品溶液均嚴格按照2020版《中華人民共和國藥典》含量測定項下各方法步驟制備。

2.2.2 色譜條件

PX Ⅲ、DISS含量測定的色譜條件：Waters XSelect CSH C18色譜柱(250 mm×4. 6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～19 min，15%A；19～19.5 min，15%→18%A；19～60 min，18%A)；柱溫30 ℃；檢測波長320 nm；進樣體積10 μL；體積流量1.0 mL/min。對照品、樣品色譜圖見圖2。

TEN含量測定的色譜條件：Waters XSelect CSH C18色譜柱(250 mm×4. 6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B)，等度洗脫(0～20 min，38%A)；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL；體積流量1.0 mL/min，ELSD漂移管溫度110 ℃；氣體流速：2.1 L/min，對照品、樣品色譜圖見圖3。

圖2 PX Ⅲ、DISS對照品(A)及樣品(B)色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of PX Ⅲ,DISS reference substances (A) and sample (B)

圖3 TEN對照品(A)及供試品(B)色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of TEN reference substance (A) and sample (B)

2.2.3 方法學驗證

線性關系考察：取“2.2.1”項下的對照品溶液的不同體積，按“2.2.2”項色譜條件測定，記錄色譜峰峰面積，以峰面積Y為縱坐標，進樣量X(μg)為橫坐標，得到標準曲線。PX Ⅲ、DISS、TEN標準曲線的線性方程分別為Y= 1 577 068.928X- 370 244.988 ，R2= 0.995；Y= 2 506 214.075X- 749 554.703，R2= 0.994；Y= 339 807.092X+ 63 135.823，R2 = 0.999。表明PX Ⅲ、DISS、TEN進樣量分別在0.72～2.70、0.96～3.60、4.86～24.30 μg內有良好的線性。

精密度、穩定性、重復性實驗取“2.2.1”項下溶液，按“2.2.2”項色譜條件測定，精密度以對照品溶液重復進樣6次；重復性以S-1-3制備6份供試品溶液分別進樣，穩定性以S-1-1供試品溶液考察24 h內穩定性。考察結果表明儀器精密度高；重復性實驗顯示，PX Ⅲ、DISS和TEN平均含量分別為1.10、8.48和24.60 mg/g，三者含量的RSD分別為和0.84%、0.85%和2.56%，重復性好；樣品24 h內穩定。其保留時間和峰面積RSD結果見表3。

表3 精密度、重復性、穩定性實驗結果(n=6)

加樣回收率：精密稱取已知PX Ⅲ、DISS含量的S-1-2樣品干燥粉末約1 g，共6份，精密加入PX Ⅲ、DISS濃度分別為0.120 5、0.112 7 mg/mL的混合對照品溶液1 mL，按“2.2.1”項下方法平行制備供試品溶液，分別進樣，測定峰面積，計算PX Ⅲ、DISS平均回收率分別為99.13%、99.71%，RSD分別為1.50%、1.58%。精密稱取已知TEN含量的S-1-2干燥粉末約1 g，共6份，精密加入濃度為1.030 5 mg/mL的TEN對照品溶液1 mL，按“2.2.1”項下方法平行制備供試品溶液，分別進樣，測定峰面積，計算TEN的平均回收率為99.86%，RSD為1.46%，表明方法準確度良好，結果見表4。

表4 加樣回收率結果

2.2.4 樣品含量測定

取12批藥材，各平行取3份，按照“2.2.1”項制備供試品溶液，按照“2.2.2”項色譜條件進樣，測定峰面積，分別計算PX Ⅲ、DISS、TEN在樣品中的含量，結果見表5。

表5 遠志三種指標性成分的含量測定

結果表明，12批藥材中DISS含量均大于《中華人民共和國藥典》規定的0.5%。汾陽產春采DISS含量高于秋采，但不具有統計學意義，在種植3年后含量累積達到最大。新絳產春采DISS含量高于秋采，春采藥材與汾陽產有類似的累積規律，在3年后達到最大累積含量；秋采中DISS隨著生長年限的增加，含量逐漸增加。

汾陽、新絳產PX Ⅲ 含量與生長年份的關系不太明顯，兩地相同生長年份秋采PX Ⅲ 含量較高，且均在種植3年后到峰值；與DISS累積規律類似。

汾陽產TEN生長2年達到含量最大值，3年達到最低值，且春采TEN含量高于秋采。新絳產在生長3年含量達到最高值，規律同汾陽一致春采高于秋采；TEN2年生含量高于4年生。

綜上，兩地春采樣品PX Ⅲ、DISS有類似的累積規律，均在生長3年出現累積最大值，與傳統的種植采收時間相符。TEN春采含量較高，且2年生高于4年生。

以上三種指標性成分的含量相加得到總含量并對其進行分析，發現汾陽產遠志相同生長年份春采總含量高于秋采，秋采藥材隨著生長年份的增加總含量逐年減少。不同采收時間的新絳產遠志均在生長第三年達到總含量的最大值，有相同的累積規律，且相同生長年份春采總含量高于秋采(見圖4)。

圖4 遠志藥材三種成分總含量Fig.4 Total content of three components of Polygalae Radix注：左圖為汾陽產；右圖為新絳產。Note:Left:Fenyang production;Right:Xinjiang production.

2.3 遠志藥材指紋圖譜的建立

2.3.1 溶液的制備

取0.5 g藥材，精密稱定，加20 mL 70%甲醇搖勻，室溫超聲提取30 min(200 W，40 kHz)，用70%甲醇補足失重。過濾，即得供試品溶液。

精密稱取PX Ⅲ、DISS對照品適量，制成0.1 mg/mL 的單獨對照品溶液和0.1 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3.2 色譜條件

Waters XSelect CSH C18色譜柱(250 mm×4. 6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)，梯度洗脫系統(0～10 min，10%→20% A；10～15 min，20%→21% A；15～20 min，21%→23% A；20～30 min，23%→26% A；30～40 min，26%→38% A；40～50 min，38%→40%A；50～70 min，40%→42% A；70～73 min，42%→10%A)，體積流量1.0 mL/min；檢測波長316 nm；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL。

2.3.3 色譜峰的指認與方法學考察

將對照品溶液按“2.3.2”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖與結果，經對照品指認，最終確認共有峰5為PX Ⅲ，峰8為DISS。峰5、8均在12批樣品中出現并完全分離。對照品色譜圖見圖5。

圖5 PX Ⅲ、DISS指紋圖譜Fig.5 HPLC fingerprint of PX Ⅲ and DISS

穩定性試驗：取S-2-1供試品溶液，與“2.2.3”項方法相同，按“2.3.2”項下色譜條件檢測指紋圖譜，獲得峰5 PX Ⅲ和峰8 DISS的保留時間RSD分別為0.48%、0.62%，峰面積RSD分別為1.34%、1.03%，說明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取S-2-1藥材，與 “2.2.3”項方法相同，按照“2.3.1”制備供試品溶液，按“2.3.2”項下色譜條件檢測指紋圖譜，獲得峰5 PX Ⅲ和峰8 DISS的保留時間RSD分別為0.68%、1.06%，峰面積RSD分別為2.34%、2.63%，重復性好。

2.3.4 指紋圖譜的建立與結果分析

取汾陽、新絳產共12批遠志供試品溶液，以“2.3.2”色譜條件分析記錄色譜圖與結果，將色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012)”，以中位數法生成遠志共有圖譜，并作為參照圖譜，采用多點校正、全峰匹配建立12批樣品指紋圖譜，樣品指紋圖譜見圖6，系統生成的對照指紋圖譜見圖7。

圖6 12批樣品HPLC指紋圖譜Fig.6 HPLC fingerprint of 12 batches of samples

圖7 12批樣品HPLC共有峰Fig.7 Common peaks of 12 batches of samples

樣品指紋圖譜相似度評價：遠志12批樣品共有35個共有峰，相似度介于0.823～0.962之間，見表6。兩地產遠志藥材相似度高，其化學成分種類相似，在含量上略有差異。12批樣品相同生長年份春采相似度高于秋采，汾陽產生長3年樣品春采和秋采的相似度均為最低。汾陽產和新絳產樣品相似度沒有統計學差異，同一基源、不同產地、不同生長年份樣品指紋圖譜相似度高。

表6 12批樣品指紋圖譜相似度評價

3 討論與結論

藥用植物中有效成分的含量及累積規律會受到基源、種植、采收及環境等多種因素的影響，藥材生長時間的延長除對藥材性狀如長度、直徑等造成直觀影響外，對有效成分的含量影響很大，進而會影響其藥效。中藥材的最佳采收期應是包含采收時間和采收年限的雙重概念，在其有效成分含量高、外觀性狀佳的時期進行采收，才能得到優質的藥材，從而達到更好藥效。本研究除對藥材性狀進行測量外，利用熱浸法、HPLC，從浸出物、PX Ⅲ、DISS和TEN的含量及指紋圖譜相似度等多方面對12批同一基源、不同年份、產地和采收時間的遠志藥材進行藥效物質累積規律的研究。

12批藥材醇浸出物含量均大于30%，DISS含量均大于0.50%；以PX Ⅲ為指標，僅有S-1-4、S-1-5的含量達到0.15%；以TEN為指標，僅S-1-1、S-2-2、S-2-5有的含量達到2.0%。文獻表明，HPLC測定遠志藥材中PX Ⅲ的合格率在50%～80%左右[13]；TEN含量范圍為1.4%～4.4%[14-16]，與本研究的結果相近。含量測定變化區間大的原因可能有PX Ⅲ存在兩種分子構型[17]和ELSD檢測器靈敏度低等。遠志藥材中所含化學成分的多樣，故以此三種化學成分的含量為指標評價遠志質量的合理性與準確性仍需考量。

本研究發現新絳產遠志含水量、浸出物含量和三種指標性成分總含量均高于汾陽產；兩地春采藥材浸出物、成分總含量均高于秋采。山西為遠志的道地產區，產區多分布于山西南部，相較于汾陽，新絳地理位置偏南，本研究表明新絳更適合遠志的種植與栽培。兩地遠志浸出物、總成分含量與采收季節有關，均表現為春季含量較高，本研究認為相同生長年份，春季采收的遠志更為合適。

藥材的藥效物質累積規律與其品種、產地和采收時間有密切的關系，藥材采收時間的確定也要考慮到品種、產地及其不同藥用部位的影響，且因治療目的的不同可能導致不同的生長期限和采收時間。可進一步探究是否能夠根據治療疾病的藥效物質基礎的不同，靈活、合理、選擇性地安排其采收時間。因本研究遠志樣品批次選取的限制性、不同批次內樣本數量的有限性、所選取測定成分的合理性，本實驗研究結果是否具有代表性、全面性還需進一步研究。另外，在全國范圍內的其他遠志種植區、不同基源遠志是否具有相同的累積規律也需要深入研究，為遠志的種植采收提供更有力可信的參考。