三種非釀酒酵母對貴人香白葡萄酒發酵進程及揮發性組分的影響

周洪江，姜文廣，阮仕立，李記明

（煙臺張裕集團有限公司，山東省葡萄酒微生物發酵技術重點實驗室，山東煙臺 264001）

香氣是決定葡萄酒品質的重要指標，是上百種揮發性化合物相互作用的結果，也是吸引消費者和增強市場競爭力的重要因素。在葡萄酒釀造中，接種商業化釀酒酵母并使其主導完成酒精發酵是常規操作，這是基于釀酒酵母（）的若干優良釀造特性，如發酵完全、酒精產率高、發酵可重復性強、抑制雜菌生長等，但是只接種商業化釀酒酵母帶來的共性問題是產品風格單一、缺乏典型性。將非釀酒酵母與釀酒酵母聯合使用，發揮每種酵母的釀造特性和優勢，形成對酒體的提升是解決以上問題的有效方法。

非釀酒酵母是一類自然存在于漿果、果梗表面、果園土壤或釀酒環境中可參與葡萄酒發酵的微生物，在發酵過程中會產生甘油、酯類、高級醇、萜類化合物等代謝產物，并且能夠分泌糖苷酶、脂肪酶、蛋白酶等多種酶類，通過酶的活性反應將果實中的香氣前體物質分解并釋放出香氣組分，從而影響葡萄酒的香氣、風味和復雜性。隨著研究者對非釀酒酵母的深入研究，非釀酒酵母的潛在應用價值受到越來越多的關注。目前葡萄酒釀造領域研究較多的非釀酒酵母主要有孢圓酵母屬（）、有孢漢遜酵母屬（）、假絲酵母屬（）、畢赤酵母屬（）、美奇酵母屬（）、克魯維酵母屬（）等，它們以不同的代謝機制影響著果酒的風味。Azzolini 等發現和釀酒酵母混合發酵能夠增加芳香醇類和酯類的合成量，明顯提升葡萄酒的香氣和復雜性，以及緩和葡萄酒的發酵進程。Whitener 等證實某些特定的戴爾有孢圓菌株可生成高濃度的萜烯化合物，如-萜品醇、芳樟醇、香葉醇等，從而提高葡萄酒的品種香氣。Hranilovic 等研究發現美極梅氏酵母（）與釀酒酵母順序接種發酵葡萄酒時，能夠促進三羧酸循環代謝產物的合成，如富馬酸、琥珀酸、甘油等，同時增加多種乙酸酯、高級醇等揮發性組分的產量。Ciani 等發現耐熱克魯維酵母（）與釀酒酵母實施混合發酵時可以改善影響葡萄酒品質和感官質量，如增加萜烯、異丁酸等芳香化合物，限制乙酸、乙醛等物質的合成，還能提高甘油、葡萄花色苷和多糖的含量。但是非釀酒酵母目前在紅葡萄酒釀造中研究及應用較多，白葡萄酒中涉及較少，急需開展相關研究。

揮發性組分的測定利用氣相色譜-離子遷移譜（Gas chromatography-ion mobility spectrometry，GCIMS）技術完成，這是近年出現的檢測風味化合物的新手段。GC-IMS 的分析原理是樣品經氣相色譜分離后，先經IMS 離子源進行離子化然后進入漂移區，根據在漂移區的遷移速率不同，不同物質按照先后順序到達檢測器，從而被檢測。相較于氣相色譜，該技術具有靈敏度高、檢測速度快、檢測限低、樣品無需復雜預處理、可用于現場快速檢測等優勢。本研究以在煙臺種植的“貴人香”葡萄為釀造原料，測試三種商業化非釀酒酵母，即戴爾有孢圓酵母（）、美極梅奇酵母（）和耐熱克魯維酵母（）與釀酒酵母混合發酵對白葡萄酒的理化指標、揮發性組分和感官品質的影響，以釀酒酵母單獨發酵的白葡萄酒為對照，分析比較三種非釀酒酵母間的區別，及其對解決白葡萄酒香氣淡、風格典型性不突出問題的貢獻，以期為在白葡萄酒中釀造應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

貴人香 釀造葡萄品種，采自煙臺萊州，2019 年9 月完成成熟采摘。果實理化指標：總糖189 g/L，總酸6.1 g/L（以酒石酸計），pH3.51；釀酒酵母Lalvin D21、美極梅奇酵母Flavia?MP346 加拿大Lallemand 公司；戴爾有孢圓酵母Prelude、耐熱克魯維酵母Concerto丹麥科漢森公司；n-酮C4～C9色譜純，國藥化學試劑北京有限公司；葡萄糖、酵母粉、瓊脂等培養基成分 分析純，國藥化學試劑北京有限公司。

FlavourSpec? GC-IMS 聯用儀（配有CTC 自動頂空進樣器、Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件及Library Search 定性軟件的GC-IMS 系統）德國G.A.S 公司；20 mL 頂空進樣瓶 寧波哈邁儀器科技有限公司；酸度計FE28 梅特勒集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 WL 營養培養基（1 L）：葡萄糖50 g，酵母粉5 g，胰蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀550 mg，氯化鈣125 mg，氯化鐵2.5 mg，氯化鉀425 mg，硫酸錳2.5 mg，硫酸鎂125 mg，溴甲酚綠22 mg，瓊脂20 g，pH6.5，121 ℃滅菌20 min。

賴氨酸瓊脂培養基（1 L）：D-葡萄糖10 g，DL-蛋氨酸2 mg，DL-色氨酸2 mg，L-組氨酸1 mg，對氨基苯甲酸200 μg，泛酸2 mg，生物素20 μg，葉酸2 μg，煙酸400 μg，鹽酸吡哆醇400 μg，核黃素200 μg，鹽酸硫胺素400 μg，肌醇10 mg，硼酸500 μg，碘化鉀100 μg，氯化銅40 μg，氯化鐵200 μg，鉬酸鈉200 μg，硫酸鋅400 μg，硫酸錳400 μg，磷酸氫二鉀150 mg，磷酸二氫鉀850 mg，氯化鈣100 mg，硫酸鎂500 mg，賴氨酸鹽酸鹽2.5 g，氯化鈉100 mg，瓊脂20 g，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 白葡萄酒發酵 將新鮮葡萄破碎擠壓出葡萄汁入發酵罐中，加入SO并使其濃度達到50 mg/L，再加入30 mg/L 的果膠酶于5 ℃下反應12 h，分離出上清液。添加適量蔗糖，使還原糖濃度達到210 g/L。將經過上述處理的葡萄汁等分為8 份，6 份用于非釀酒酵母/釀酒酵母混合發酵，2 份為釀酒酵母單獨發酵，即每組發酵酒樣均有2 組平行樣品。

每份葡萄汁倒入20 L 小型發酵罐中，進行葡萄酒發酵實驗。所有酵母在使用前均需要進行充分活化，即將酵母置于20%蔗糖水溶液中，30 ℃下輕輕攪拌至酵母產生豐富氣泡，而后直接接種于葡萄酒中。為便于區分四種發酵葡萄酒，對其進行代碼命名。將接種美極梅奇酵母Flavia?MP346、戴爾有孢圓酵母 Prelude和耐熱克魯維酵母Concerto的混合發酵葡萄酒分別用M1、M2、M3 表示，釀酒酵母Lalvin D21 單獨發酵的葡萄酒用M4 表示。

M1、M2、M3 中先分別上述接種商業化非釀酒酵母，接種量為250 mg/L，24 h 后接種釀酒酵母Lalvin D21，接種量為300 mg/L。20 ℃恒溫發酵，并監測白葡萄酒中的酵母增殖情況和還原糖濃度變化情況，直至還原糖濃度小于4 g/L。M4 中釀酒酵母的接入量為250 mg/L，其它處理與以上三種樣品完全相同。上述樣品中酵母增殖情況通過檢測酵母的活細胞數進行表征，測定方法見1.2.3；還原糖濃度測定方法見1.2.4。

發酵結束后將SO加入到酒樣品中，使游離SO濃度達到30 mg/L，所有樣品均保存于4 ℃冰箱中，待后續完成理化指標以及揮發性香氣組分測定。

1.2.3 酵母活細胞數的測定方法 WL 鑒別培養基和賴氨酸瓊脂培養基分別應用于釀酒酵母和非釀酒酵母的菌落計數，并采用梯度稀釋法對它們在發酵過程中的增殖情況進行培養和計數。取5 mL 酒樣，用無菌生理鹽水梯度稀釋后（稀釋倍數為10～10），涂布于WL 營養培養基，在28 ℃好氧條件下培養48 h后統計釀酒酵母的數目。相同的酒樣經無菌生理鹽水梯度稀釋后，涂布于賴氨酸培養基，在28 ℃好氧條件下培養72 h 后統計非釀酒酵母的數量。菌體量的表示方法為CFU/mL。

1.2.4 理化指標測定 酒精度、總糖、總酸、揮發酸的測定方法參照《葡萄酒、果酒通用分析方法》（GB/T 15038-2006）執行。其中：酒精度采用密度瓶法；總糖采用斐林氏劑滴定法測定，以葡萄糖計；揮發酸和總酸：采用氫氧化鈉滴定法測定，分別以乙酸和酒石酸計。pH 采用酸度計測定。每個樣品檢測3 次。

1.2.5 揮發性組分分析 取1 mL 樣品，放入20 mL頂空進樣瓶中，保溫孵化后經頂空進樣，用氣相離子遷移譜儀FlavourSpec?進行測試。每個樣品分析3 次。

頂空進樣條件：頂空孵化于60 ℃，孵化10 min；振蕩加熱；頂空進樣針溫度為65 ℃；進樣量為100 μL，不分流模式。

GC 條件：載氣為高純氮氣（純度≥99.999%），流速設定為2 mL/min，保持2 min，8 min 上升至30 mL/min，10 min 第二次上升至150 mL/min，保持150 mL/min，持續10 min。

IMS 條件：漂移管長度98 mm；漂移管溫度45 ℃；管內線性電壓5 kV/cm；漂移氣為N（純度≥99.999%），漂移氣流速150 mL/min；放射源為3H；離子化模式為正離子。

1.2.6 香氣感官質量評價 利用定量描述分析法對白葡萄酒進行香氣感官質量分析，由15 位具有葡萄酒品評經驗的品評者（6 名女性，9 名男性，年齡21～52 歲）組成感官評價小組。在正式品評之前，小組成員先接受葡萄酒描述性感官分析的培訓，通過進行多次檢驗與討論，品評小組確定了葡萄酒中主要的香氣屬性特征，包括果香、花香、植物香、蜂蜜、化學味及整體香氣。品評實驗在感官評價室進行，室溫20 ℃，通風良好，無噪音，無任何氣味。以3位數字隨機編碼12 份葡萄酒樣品，平均分為2 組呈送給評價員。評價員按順序聞香，并采取10 點制打分，0 表示無，9 表示特征性最強。0.0～3.0：香氣屬性微弱；3.1～6.0：香氣屬性強度適中，與其它屬性平衡；6.1～9.0：呈現典型的、濃郁的屬性香氣，且與其它屬性協調。

1.3 數據處理

樣品中揮發性組分的鑒定通過GC-IMS 聯用儀自帶分析軟件LAV（Laboratory Analytical Viewer）、定性軟件GC×IMS Library Search（內置NIST2014、IMS 數據庫）完成。運用LAV 中插件Reporter 進行樣品GC-IMS 譜圖對比，用插件Gallery Plot 進行GCIMS 指紋圖譜的對比。

采用設備自帶的Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件及Library Search 定性軟件對葡萄酒的風味物質成分進行分析，以n-酮C4～C9 為外標參照物，通過插值法計算遷移時間與保留指數（RI）的對應關系，獲得RI 值，并利用軟件內置的NIST 數據庫和IMS 數據庫對物質進行定性分析。

采用SPSS Statistics 21.0 軟件對獲取的葡萄酒樣品的各指標數據做方差分析（ANOVA）和顯著性差異（＜0.05）分析。利用SPSS Statistics 21.0 軟件中的主成分分析方法（PCA），對所得葡萄酒的香氣成分指標進行降維處理，旋轉方法采用最大方差法。

2 結果與分析

2.1 發酵過程跟蹤情況

分別使用WL 鑒別培養基和賴氨酸瓊脂培養基對釀酒酵母和非釀酒酵母細胞增殖情況進行培養和統計。釀酒酵母在賴氨酸培養基上不能生長，因而可以利用該培養基對非釀酒酵母的活細胞數進行統計；而兩類酵母在WL 培養基上的菌落形態及顏色差異較大，因而可以利用WL 培養基對釀酒酵母的生長情況進行計數。

四種白葡萄酒發酵過程中的酵母細胞生長和還原糖消耗情況見圖1。在混合發酵樣品中，非釀酒酵母優先接種，從圖1A、1B 和1C 中可以看出，美極梅奇酵母、戴爾有孢圓酵母和耐熱克魯維酵母均能較好地適應各自的發酵環境，在微氧條件下快速繁殖，細胞數量急劇增加。發酵24 h 后接種Lalvin D21，它能夠耐受非釀酒酵母產生的競爭性抑制，自接種之初便維持較高的發酵速率。非釀酒酵母在與釀酒酵母共發酵的環境中表現不同，戴爾有孢圓酵母的活細胞數仍在穩步增加，耐熱克魯維酵母也能實現較好的生長，美極梅奇酵母卻被明顯抑制，活細胞數在混合發酵24 h 后開始下降。美極梅奇酵母、戴爾有孢圓酵母和耐熱克魯維酵母分別于第2、3 和3 d 達到峰值，活細胞數分別達到7.39、8.12 和7.40 lg（CFU/mL）。釀酒酵母在M1、M2、M3 三個混合發酵樣品中達到生長峰值均在第4～5 d，活細胞數分別是8.17、7.68 和9.98 lg（CFU/mL）。隨著發酵的進行，醪液中的糖分和營養素大部分被消耗掉，酵母開始衰老死亡，數量逐漸減少。所有混合發酵樣品均在第8 d完成發酵。由圖1D 可知，M4 酒樣中的釀酒酵母D21 在接種 3 d 時活細胞數達到最高，之后菌體數量緩慢下降，并于第 7 d 完成發酵。綜上，混合發酵較之M4 樣品延長了1 d。此外，針對還原糖的消耗而言，在M1、M2 和M3 葡萄酒中，兩種酵母從共存起始至發酵結束（第2～8 d），還原糖消耗速率分別是23.6、19.8 和21.9 g/（L·d），而對照樣品（M4）中還原糖代謝速率為29.6 g/（L·d），說明釀酒酵母單獨發酵時能夠更快速的利用糖類促進自身的生長及乙醇的合成。

圖1 白葡萄酒中酵母的增殖進程和還原糖代謝過程Fig.1 Growth kinetics of yeasts and sugar consumption in white wines.

2.2 白葡萄酒理化指標比較

發酵結束后對葡萄酒的理化指標進行檢測，結果經均值化處理和標準差計算后見表1。所有樣品的總糖含量都低于4 g/L，表明發酵比較充分，殘糖含量較低，均為干型葡萄酒。酒精度在10.81%vol～11.58%vol 之間，M4 酒樣最高，M1 最低。pH 在3.45～3.60 范圍內，M1、M2 和M4 之間差異較小，M3 最低?？偹嵩?.52～6.37 g/L 之間，以M3 最高，證實了耐熱克魯維酵母具有產酸能力。揮發酸的濃度在0.19～0.38 g/L之間，M4 葡萄酒的該數值較高。

表1 不同發酵模式釀造貴人香白葡萄酒理化指標Table 1 Compositional profile of Italian Riesling white wines resulting from different fermentations

2.3 白葡萄酒揮發性組分的比較

發酵結束后，利用GC-IMS 對白葡萄酒的揮發性香氣組分進行檢測，結果以三維譜圖（保留時間，遷移時間和峰強度）形式呈現。為了更直觀地反映每種葡萄酒揮發性組分的差異，使用俯視圖進行表示（圖2），這是通過對離子遷移時間和反應離子峰（RIP）的歸一化而獲得的橫坐標1.0 處的紅色垂直線是反應離子峰（RIP）。每個RIP 代表一種風味化合物，顏色表示其信號強度。紅色表示高濃度，白色表示低濃度，紅色越深表示該揮發性組分的濃度越高。根據揮發性化合物氣相色譜保留時間和離子遷移時間對葡萄酒揮發性香氣化合物進行分析，共計鑒定出34 種揮發性化合物，包括酯類、醇類、醛類、酮類、酸類和萜烯類物質。每種化合物的檢測結果經均值化處理和標準差計算后見表2。由表中數據可以看出，接種不同非釀酒酵母發酵葡萄酒的揮發性成分信號強度差異較大。此外，利用揮發性指紋圖譜快速對比出不同葡萄酒樣品風味物質之間的差異（圖3），圖中每一行代表一個葡萄酒揮發性組分的全部信號峰，每一列代表同一揮發性有機物在不同樣品中的信號峰強度。從圖中可以清晰看出每種葡萄酒的完整揮發性組分信息以及樣品之間揮發性組分的差異。

表2 不同發酵模式釀造貴人香白葡萄酒揮發性組分的信號強度Table 2 Signal intensities of volatile compounds detected in Italian Riesling white wine resulting from different fermentations by GC-IMS

圖2 不同發酵模式釀造貴人香白葡萄酒中揮發性化合物的GC-IMS 圖譜Fig.2 GC-IMS patterns of volatile compounds in Italian Riesling white wines resulting from different fermentations

圖3 混合發酵對貴人香白葡萄酒揮發性指紋圖譜的影響Fig.3 Gallery plot of volatile fingerprints of Italian Riesling white wines resulting from combined fermentations.

2.3.1 酯類 酯類物質是貴人香白葡萄酒的最主要風味物質，對酒的整體香氣具有重要貢獻。本研究共檢測到16 種酯類物質，信號強度最高的是乙酸乙酯、乙酸異戊酯和己酸乙酯。表2 結果顯示，M4 的酯類信號總強度最低，而混合發酵則顯著提高了多種揮發性酯類化合物的信號強度，包括異丁酸乙酯、乙酸異丁酯、異戊酸乙酯、己酸乙酯、己酸丙酯、庚酸乙酯和辛酸乙酯。以己酸乙酯為例，該物質能夠散發出花香果香等氣息，其在M4 中的強度為333.19，接種了三種商業化非釀酒酵母，即美極梅奇酵母、戴爾有孢圓酵母和耐熱克魯維酵母進行混合發酵后，該物質在M1、M2 和M3 的強度分別提升了9.4、7.3 和7.4 倍。就三種混合發酵的葡萄酒而言，M1 和M2酒樣中的揮發性酯類總強度最高，M3 次之。丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和乙酸異戊酯能夠釋放類似草莓、香蕉、青蘋果等果香香氣，乙酸異丁酯呈花香，這些酯類化合物在M1 和M2 樣品中的濃度較高，可能增強上述兩種葡萄酒的果香或花香，提高其風味復雜性。

2.3.2 醇類 葡萄酒中的揮發性醇類化合物主要來源于發酵、氨基酸的轉化及亞麻酸降解物的氧化。當酒中的高級醇質量濃度適中時，有助于提高葡萄酒的風味復雜性，但當其濃度過高時，就會對感官質量帶來負面影響。貴人香白葡萄酒中共檢測出6 種醇類物質，總強度最高的是M1，M3 次之，最低的是M4。M1 樣品顯著提升了正丁醇、3-甲基丁醇和正己醇和含量，其它兩組混合發酵主要增加了丙醇和2-甲基丙醇的合成量。乙醇含量在各樣品間的差異較小。

2.3.3 醛酮類 貴人香葡萄酒中還檢測到了2 種醛類化合物（丁醛、苯甲醛）和3 種酮類（丙酮、2-戊酮、2,3-丁二酮）。苯甲醛具有苦杏仁氣味，在M4 酒樣中信號強度最高（618.388），分別是M1、M2 和M3樣品的2.3、3.0 和2.8 倍。2-戊酮具有果香味，丁二酮散發黃油味，這兩種酮類組分在M1 樣品中信號強度最高，可能使得M1 風味更復雜。它們在M2 和M3 中含量差異較小，在M4 中濃度最低。

2.3.4 其它揮發組分 除揮發性酯類、醇類、醛類、酮類物質以外，白葡萄酒中還檢測出2 種揮發酸類（乙酸、3-甲基丁酸）、3 種萜烯和雜環類物質（-松油烯、苯乙烯、芳樟醇）和2 種內酯類化合物（-辛內酯和-壬內酯）。乙酸是具有典型酸味的化合物，在M4 樣品中信號強度最高（4284.770），分別是M1、M2和M3 樣品的2.6、3.4 和4.1 倍。萜烯類和雜環類化合物會為葡萄酒帶來一定程度的花香甜味和草木味，富含這類化合物可能會賦予葡萄酒更加豐富的香氣風格。與釀酒酵母單獨發酵相比，戴爾有孢圓酵母—釀酒酵母混合發酵提升了-松油烯的含量（M2樣品），美極梅奇酵母—釀酒酵母混合發酵則增加了芳樟醇的合成量（M1 樣品）。-松油烯和芳樟醇分別具有檸檬、鈴蘭氣味，可能增強上述兩種葡萄酒的果香或花香，增強其風味特征。

2.4 主成分分析

為了進一步了解混合發酵對白葡萄酒中香氣成分的變化，對其進行主成分分析（PCA）。由圖4 可得，PC1 和PC2 對總方差的解釋率分別為52.3%和37.5%，該兩個主成分對初始數據總方差的解釋率為89.8%，能體現葡萄酒的香氣成分信息。

圖4 貴人香白葡萄酒PCA 分類結果及與香氣組分的對應關系Fig.4 PCA score plots of Italian Riesling white wines resulting from different fermentations and corresponding loadings of volatile variables.

酒樣M1 位于載荷圖中的第一象限，并與PC1和PC2 正向端含量較高的相關變量有關，包括己酸乙酯、異丁酸乙酯、異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸己酯、-壬內酯、-辛內酯、己醇、丁醇、3-甲基丁醇、2-戊酮、2,3-丁二酮、芳樟醇。酒樣M2 和M3 比較類似，分布在第四象限，與PC2 負向端含量較高的辛酸乙酯、乙酸丙酯、丙酸乙酯、-松油烯、丙酮、丙醇有關。M4 與其它酒樣的香氣成分含量差異較大，位于第三象限，與PC1 負向端含量較高的甲酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、3-甲基丁酸、苯甲醛、苯乙烯有關。

2.5 香氣感官質量分析

雖然采用HS-GC-IMS 對不同混合發酵模式的貴人香白葡萄酒揮發性成分進行了檢測分析，但其結果不能完全體現出酒體的整體香氣質量，因此由一個訓練有素的15 人小組對酒體香氣進行感官評估分析，評價樣品的香氣特征，包括果香、花香、植物香、蜂蜜、化學味及整體香氣，結果如圖5 所示。

圖5 貴人香白葡萄酒香氣品質定量分析結果Fig.5 Average values of sensory evaluation scores of Italian Riesling white wines resulting from different fermentations.

酒樣M1 具有濃郁的果香，中等強度的花香，以及一定強度的蜂蜜、植物和化學味，整體香氣質量得分最高。酒樣M2 和M3 的香氣質量的評分結果比較相似，果香、花香的評分值是分別為M1 的83.1%～90.4%、84.9%～89.8%，但以上兩種屬性的評分M2均高于M3，而M3 的化學味強度高于M2。M4 在花香和果香屬性上的得分都低于其他三個酒樣，植物味和化學味評分均最高，整體香氣得分最低。

3 討論

3.1 混合發酵對酵母細胞增殖的影響

在混菌發酵的環境中，非釀酒酵母和釀酒酵母的共生可能會有多種表現，如相互促進、互不干擾或產生抑制。在本文研究的混合發酵組合中，戴爾有孢圓酵母和耐熱克魯維酵母能夠更好地與釀酒酵母共存，其自身的增殖未受到明顯影響，在發酵結束時兩種非釀酒酵母在各自發酵環境中的活細胞數仍然達到6.31×10和9.77×10CFU/mL。據文獻報道，該兩類非釀酒酵母均屬于溫和發酵型酵母，增殖速率較慢，與釀酒酵母協同發酵時容易被釀酒酵母抑制，但某些菌株能夠分泌弒殺同環境中其它微生物的分泌物，以保障自身的優勢存活。在本研究中戴爾有孢圓酵母和耐熱克魯維酵母在混合發酵葡萄酒環境中的增殖均未見明顯抑制作用，可能也是上述原因所致。與以上結果形成鮮明對比的是M1 樣品，美極梅奇酵母的增殖被釀酒酵母顯著抑制，前者在發酵結束時的活細胞數僅為其峰值時的0.9%。該研究結果與Alexandre 團隊和Sun 等比較一致，這可能與釀酒酵母分泌的某些針美極梅奇酵母生長有關的弒殺毒素或代謝物有關，使其在與釀酒酵母競爭的生長環境中處于劣勢，活細胞數迅速下降。

3.2 混合發酵對基本理化指標的影響

本研究測試了三種非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵對白葡萄酒基本組成的影響，發現與釀酒酵母單獨發酵相比，混合發酵明顯降低了酒體的酒精濃度。之所以出現上述結果，與它們利用糖類合成酒精的能力不及釀酒酵母有關。而揮發酸濃度下降則與所用釀造菌種低產乙酸的能力有關，雖然較早的研究一度認為發酵時混入非釀酒酵母是造成葡萄酒品質低劣的主要原因，但隨著研究的逐步深入，研究者和釀酒師發現在釀造實踐中非釀酒酵母能夠改善葡萄酒的風味物質組成，如增加揮發性酯類含量，降低乙酸含量，從而改善產品的整體品質。再者，利用GC-IMS 獲得的揮發性物質數據也能說明該問題，M1、M2 和M3 酒樣中的乙酸信號強度顯著低于M4，說明混合發酵在一定程度上限制了乙酸的合成。本文中所測試的三種商業化非釀酒酵母，即美極梅奇酵母、戴爾有孢圓酵母和耐熱克魯維酵母均屬于低產乙酸的菌株，對提高白葡萄酒的品質具有積極作用。

3.3 混合發酵對揮發性組分的影響

揮發性香氣化合物的種類、含量及相互作用是形成葡萄酒香氣特征的化學基礎，因此對揮發性組分進行有效分析是闡明葡萄酒香氣特征的前提。本研究運用GC-IMS 技術分析不同葡萄酒的揮發性香氣指紋圖譜，通過信號峰的數量和信號強度進而綜合判斷不同混合發酵模式對葡萄酒香氣化合物的影響和差異。

近年來非釀酒酵母引起廣泛關注的一個重要原因是其對葡萄酒香氣的積極影響，有望增加多種有益揮發性物質的含量，如酯類、醇類、萜烯、硫醇等，從而提升果酒的香氣復雜性和品種特異性。以本研究中涉及的三種非釀酒酵母為例，據報道，戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母混合發酵能夠在一定程度上降低葡萄酒中乙醛、乙酸和部分高級醇的生成量，增加乳酸乙酯、己酸乙酯等乙酯類化合物濃度，并能釋放較高濃度的萜烯。但也有文獻指出戴爾有孢圓酵母對葡萄酒香氣無影響甚至有負面作用，可能與菌株特異性和發酵條件特異性等有關。據研究，美極梅奇酵母與釀酒酵母混合接種時可以增加酯類、萜烯、中鏈脂肪酸和高級醇產量，提高葡萄酒中的果香特征和總體得分。利用耐熱克魯維酵母作為產香酵母與釀酒酵母實施混合發酵時可以提高萜烯、異丁酸等揮發性組分的生成量，同時減少乙酸、乙醛等物質的合成。

從本研究獲得的實驗結果來看，較之釀酒酵母單獨發酵，接種戴爾有孢圓酵母的葡萄酒提升了丙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、異丁酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、-辛內酯、2,3-丁二酮、-松油烯等多種酯類、酮類化合物的含量，但是對萜烯類化合物的釋放程度低于釀酒酵母單獨發酵。萜烯類物質一般都具有果香花香特征，多以非揮發性糖苷結合態存在，只有降解成揮發性游離態時才能增強感官香氣。本研究中測試的商業化戴爾有孢圓酵母適應葡萄酒發酵環境時可能未完全激活其β-葡萄糖苷酶活性，所以未能將萜烯類前體物質進行徹底分解。M3樣品的檢測結果與M2 具有一定的相似性，因此在主成分分析時二者位于同一象限，距離接近。接種美極梅奇酵母的葡萄酒則全面提升了揮發性酯類、醇類、醛酮類的含量，多種具有花香、果香、品種香的化合物均在M1 樣品中信號強度最大，如異丁酸乙酯、乙酸異丁酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、-辛內酯、乙酸己酯、己酸丙酯、庚酸乙酯、3-甲基丁醇、己醇、2-戊酮、2,3-丁二酮、芳樟醇等。不同非釀酒酵母的生理活性及代謝過程不同，對風味物質的影響也不同。本研究中M1 酒樣中揮發性芳香化合物的強度最高，說明該商業化美極梅奇酵母雖然不能完全適應與釀酒酵母共存的葡萄酒發酵環境，但能仍高效合成與香氣合成有關的酶類，如酯酶、脂肪酶、-葡萄糖苷酶等，因此能較充分的分解多種香氣前體物質，從而生成較多的芳香化合物。

3.4 白葡萄酒感官評定與香氣組分之間的關系

香氣感官質量分析結果表明非釀酒酵母-釀酒酵母混合發酵對提升葡萄酒的香氣品質貢獻較大，因為混合發酵葡萄酒的評分均高于釀酒酵母單獨發酵。M1 貴人香白葡萄酒總體評分最高，M2 次之，其次是M3，得分最低的是M4。品評結果與本實驗中GCIMS 揮發性組分測定結果基本符合，M1 生成了豐富的酯類和萜烯類化合物，如己酸乙酯、異丁酸乙酯、異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、γ-壬內酯、δ-辛內酯、芳樟醇，以上這些揮發性化合物具有多樣的水果香氣和花香，因而能夠賦予M1 酒樣更濃郁的上述兩種屬性。M2 和M3 樣品中大多數化合物的信號強度低于M1，所以在多個香氣屬性上的評分均低于M1。M4 樣品中含有較高濃度的乙酸異丁酯、乙酸、丙酮等具有溶劑氣味的揮發性組分，因此化學味最為強烈，造成其總體香氣得分較低。

4 結論

本研究比較三種商業化非釀酒酵母，即戴爾有孢圓酵母、美極梅奇酵母和耐熱克魯維酵母分別與釀酒酵母混合發酵對貴人香白葡萄酒品質的影響，特別是對發酵進程、揮發性組分含量和香氣質量的影響。研究結果顯示，在混合發酵過程中，美極梅奇酵母易被釀酒酵母所抑制，最大活細胞數僅有釀酒酵母的16.6%；而其它兩種產香酵母則能與釀酒酵母良好共存。就揮發性組分而言，美極梅奇酵母能夠增加貴人香白葡萄酒中多種與花香、果香有關的揮發性酯類、萜烯類化合物的合成量，如己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、芳樟醇等，顯著提高了產品的感官品質。戴爾有孢圓酵母和耐熱克魯維酵母對白葡萄酒的香氣品質提高也有貢獻，增強了產品的復雜性，整體香氣得分分列第2 和第3 位。本研究對指導白葡萄酒及其他果酒的釀造生產具有重要的理論價值和借鑒意義，也凸顯了根據發酵目的合理選擇釀造微生物的重要性。