體外模擬消化對(duì)鮮切蘋果皮渣黃酮類物質(zhì)及其還原力的影響

常 虹，王 爽，周家華，李文生，王云香，王寶剛,

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與食品營(yíng)養(yǎng)研究所，北京 100097；2.果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)研究所，北京 100093）

蘋果因其口感爽脆多汁，酸甜可口，且具有美容養(yǎng)顏安神、增強(qiáng)記憶、提升智力等作用，所以又被稱為“智慧果”，深受各個(gè)年齡段人群的喜歡；我國(guó)蘋果的產(chǎn)量和消費(fèi)水平均位居世界前列。隨著消費(fèi)水平的提高，鮮切蘋果迅速發(fā)展起來(lái)，鮮切蘋果方便、快捷、新穎，并富含多種抗氧化活性物質(zhì)，受到了消費(fèi)者的青睞，在家庭消費(fèi)及餐飲行業(yè)特別是快餐和配餐行業(yè)中廣受歡迎。目前在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)鮮切蘋果的規(guī)范化和系統(tǒng)化生產(chǎn)，在鮮切產(chǎn)品消費(fèi)中占有重要地位，在我國(guó)的發(fā)展前景也極為可觀。

鮮切蘋果是供消費(fèi)者或餐飲行業(yè)即食的輕度加工產(chǎn)品，因此對(duì)原料的成熟度、含糖量及營(yíng)養(yǎng)成分含量等要求高，宜選擇不容易軟化、粉質(zhì)化品種如富士等，蘋果皮渣產(chǎn)量約占蘋果總量的20%～30%，大量皮渣被廢棄或填埋，造成資源浪費(fèi)。皮渣中含有甚至超過(guò)果肉的營(yíng)養(yǎng)成分，除了豐富的膳食纖維外，還有酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)和二十八烷醇等物質(zhì)，蘋果中將近一半的V也在緊貼果皮的部位。黃酮類成分是蘋果皮渣的最主要成分，主要包括黃烷醇類、黃酮醇類、二氫查耳酮類等，其總含量為834.2～2300.3 mg/kg，遠(yuǎn)高于果肉中15～605.6 mg/kg 的含量，且具有很高的藥用價(jià)值，對(duì)于預(yù)防心血管疾病、冠心病等慢性疾病有一定的治療效果。因此鮮切蘋果皮渣具有極強(qiáng)的利用價(jià)值。

近幾年，生物活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分的體外模擬消化研究受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。相對(duì)于體內(nèi)消化，體外模擬胃、腸等的消化更為簡(jiǎn)單、易行、有效，可以在一定程度上反映食品、藥品等在體內(nèi)的變化規(guī)律，易于控制，省時(shí)省力，常用來(lái)分析食品、藥品及活性物質(zhì)消化前后結(jié)構(gòu)變化、生物利用度及消化率等。目前關(guān)于富含黃酮類物質(zhì)的鮮切蘋果皮渣這一加工副產(chǎn)物的消化過(guò)程變化報(bào)道較少。本文嘗試通過(guò)體外模擬胃腸消化方法，評(píng)價(jià)鮮切蘋果皮渣黃酮粗提物在消化過(guò)程中含量及還原力的變化規(guī)律，以期對(duì)鮮切蘋果皮渣黃酮進(jìn)行更加全面科學(xué)的判斷和評(píng)價(jià)，為鮮切蘋果加工副產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品以及保健品等行業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅富士蘋果 產(chǎn)地為新疆，市售；胃蛋白酶（30000 U/g）、胰酶（4000 U/g）、-淀粉酶（4000 U/g）生化試劑，上海源葉生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、氯化鈣、氯化鈉、硝酸鋁、氯化鉀、三氯乙酸、碳酸氫鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、亞硝酸鈉、三氯化鐵、無(wú)水乙醇等 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SpectraMax iD3 多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)分子儀器公司；HZC-250 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；JA5002 電子天平 上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；LGJ-10F 真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；CP225D 分析天平 SARTORIUS公司；MDF-382E（N）型超低溫冰箱 日本三洋公司；DR04 型冷柜 青島海爾特種電冰柜有限公司；蘋果自動(dòng)去皮切瓣機(jī) 北京燕誠(chéng)集團(tuán)；SY-1000E 多用途恒溫超聲波提取機(jī) 北京弘祥隆生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；HHS 型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮提取方法 蘋果經(jīng)過(guò)鮮切生產(chǎn)線上的自動(dòng)去皮切瓣機(jī)后收集皮渣。將皮渣速凍后，進(jìn)行真空冷凍干燥處理，干燥后的皮渣打粉，過(guò)100 目篩備用。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取蘋果皮渣粉末與85%乙醇，料液比為1:15（w/v），置于恒溫超聲波提取機(jī)中，超聲功率600 W，40 ℃超聲60 min，冷卻后抽濾，再將濾渣按上述條件重復(fù)提取1 次，合并濾液。將濾液真空濃縮，濃縮比例為30:1（體積比），然后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 體外模擬消化 體外模擬消化包括口腔、胃消化和腸道消化三部分。先進(jìn)行口腔和胃消化，然后進(jìn)行腸消化。

1.2.2.1 消化液的配制 模擬唾液：配制-淀粉酶/CaCl溶液，將0.00918 g-淀粉酶和0.015 g 無(wú)水氯化鈣加水定容至100 mL。

體外模擬胃液：在500 mL 胃電解質(zhì)溶液中加入0.0135 g 胃蛋白酶，混合均勻后用1 mol/L HCl調(diào)pH 至2。稱取氯化鈉3.1 g、氯化鉀1.1 g、氯化鈣0.15 g、碳酸氫鈉0.6 g，溶解后定容至1 L，配制成胃電解質(zhì)溶液。

體外模擬腸液：向100 mL 腸電解質(zhì)溶液中加入同體積的胰酶溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH 至7（用1 mol/L NaHCO調(diào)節(jié)）。稱取5.4 g 氯化鈉、0.65 g 氯化鉀、0.33 g 氯化鈣，溶解后定容至1 L，配制成腸電解質(zhì)溶液。胰酶溶液：7 g 胰酶溶于100 mL 去離子水，6000 r/min 離心10 min，取上清待用。

1.2.2.2 模擬口腔和胃消化 參照文獻(xiàn)[22-23]的方法并稍做改進(jìn)。將黃酮提取液分別稀釋1、2、4 倍，配成高、中、低濃度，分別取1 mL，加入-淀粉酶/CaCl溶液（模擬唾液），混勻后在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩10 min（模擬口腔消化），然后加入體外模擬胃液10 mL（酸對(duì)照組為黃酮中濃度稀釋液，不添加胃蛋白酶的胃電解質(zhì)溶液，調(diào)節(jié)pH 為2；空白對(duì)照組為黃酮中濃度稀釋液，不調(diào)節(jié)pH 的胃電解質(zhì)溶液），調(diào)節(jié)樣品組pH 為2，然后于37 ℃恒溫?fù)u床150 r/min 進(jìn)行胃消化，分別于消化0、0.5、1、2 h 后取樣，6000 r/min 離心10 min，取上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 模擬腸消化 參照文獻(xiàn)[13,23]的方法并稍做改進(jìn)。將上述不同稀釋倍數(shù)黃酮提取液經(jīng)過(guò)模擬口腔和胃消化后，在消化液中加入體外模擬腸液10 mL（空白對(duì)照組為黃酮中濃度稀釋液，加入腸電解質(zhì)溶液，不添加胰酶），開(kāi)始模擬腸道消化階段。調(diào)節(jié)樣品組和空白對(duì)照組的pH 至7.2（用1 mol/L NaHCO調(diào)節(jié)），然后置于恒溫?fù)u床中150 r/min、37 ℃進(jìn)行消化培養(yǎng)，分別于0、0.5、1、2、3、4 h 取樣，6000 r/min離心10 min，取上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 黃酮含量的測(cè)定 采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法取0.5 mL 樣品液，加入5%亞硝酸鈉溶液0.15 mL，靜置6 min 后加入0.15 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min，加入4% NaOH 溶液2 mL，加蒸餾水定容至5 mL，振蕩混勻，靜置3 min，在508 nm 處測(cè)定吸光值。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定黃酮總含量。

1.2.4 還原能力的測(cè)定 采用普魯士藍(lán)法，移取0.5 mL 模擬胃、腸消化液，依次加入0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）1.25 mL 和1%的六氰合鐵酸鉀溶液1.25 mL，50 ℃水浴20 min，快速冷卻，再加入10%三氯乙酸1.25 mL，3000 r/min 離心10 min，移取上清液1.25 mL，依次加入1.25 mL 蒸餾水，0.1%三氯化鐵溶液0.25 mL，振蕩搖勻，靜置10 min，在波長(zhǎng)為700 nm 處測(cè)定其吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用三次平均值±SD 表示。采用 SPSS22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析（ANOVA），LSD 檢驗(yàn)，以＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬消化對(duì)鮮切蘋果皮渣黃酮釋放量的影響

2.1.1 體外模擬胃消化 體外模擬胃消化過(guò)程中鮮切蘋果皮渣黃酮釋放量的變化情況如圖1、圖2 所示。

圖1 體外模擬胃消化對(duì)不同濃度鮮切蘋果皮渣黃酮釋放量的影響Fig.1 Effect of in vitro simulated gastric digestion on flavonoid release from fresh-cut apple residue at different concentrations

圖2 體外模擬胃消化中胃蛋白酶對(duì)鮮切蘋果皮渣黃酮釋放量的影響Fig.2 Effect of pepsin on flavonoid release from fresh-cut apple residue in vitro simulated gastric digestion

由圖1 可見(jiàn)，三種不同濃度的黃酮提取液在相同模擬胃消化環(huán)境中發(fā)生的整體變化趨勢(shì)均表現(xiàn)為含量上升。胃消化過(guò)程中，不同濃度間黃酮含量差異顯著（＜0.05）。1 倍稀釋組在消化0.5 h 以后釋放量開(kāi)始顯著上升（＜0.05），1 h 達(dá)到最大值，而后釋放量略有下降；2 倍稀釋組和4 倍稀釋組黃酮含量在1 h后顯著上升（＜0.05），證明隨著胃消化時(shí)間延長(zhǎng)，黃酮是一個(gè)持續(xù)緩慢釋放的過(guò)程。

圖2 所示，胃消化階段，胃液消化組、酸對(duì)照組和空白組三組的變化趨勢(shì)。有胃蛋白酶的胃液消化組和無(wú)胃蛋白酶的酸對(duì)照組，采用中濃度黃酮提取液（即2 倍稀釋）黃酮含量在模擬胃消化過(guò)程中顯著增加（＜0.05），逐漸趨于穩(wěn)定，空白組在消化過(guò)程中黃酮含量下降后趨于穩(wěn)定，這表明胃蛋白酶和胃酸對(duì)黃酮的釋放均具有一定的促進(jìn)作用，且加有胃蛋白酶的胃消化模擬體系中皮渣黃酮含量高于無(wú)胃蛋白酶的酸消化模擬體系，說(shuō)明胃蛋白酶對(duì)黃酮釋放的促進(jìn)作用高于酸對(duì)照組。

胃消化過(guò)程中，黃酮釋放量的顯著升高可能是由于部分蛋白質(zhì)在胃蛋白酶的作用下水解，使得被大分子蛋白質(zhì)包埋的黃酮類物質(zhì)被釋放出來(lái)；也可能是胃蛋白酶的作用使多酚-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，多酚脫離蛋白質(zhì)分子的束縛；黃酮類物質(zhì)屬于多酚中具有高抗氧化活性的一類物質(zhì)，含量增加還可能是胃蛋白酶減弱了部分酚酸與細(xì)胞壁間的酯鍵，使酚酸從細(xì)胞壁中脫離。而酸性環(huán)境同樣有此類效果，例如野櫻莓、黑果枸杞中多酚的體外消化試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)酶解和pH 變化更易于使多酚類物質(zhì)由結(jié)合態(tài)變?yōu)樽杂蓱B(tài)。

2.1.2 體外模擬腸消化 體外模擬腸消化過(guò)程中鮮切蘋果皮渣黃酮釋放量的變化情況如圖3 和圖4 所示。

圖3 體外模擬腸消化對(duì)不同濃度鮮切蘋果皮渣粗提液黃酮釋放量的影響Fig.3 Effect of in vitro simulated intestinal digestion on flavonoid release of crude extracts of fresh-cut apple residue from fresh-cut apple residue at different concentrations

圖4 體外模擬腸消化中胰酶對(duì)鮮切蘋果皮渣黃酮釋放量的影響Fig.4 Effect of pancreatic enzymes on the release of flavonoids from fresh-cut apple residue in vitro simulated intestinal digestion

經(jīng)模擬胃環(huán)境消化后，進(jìn)入模擬腸消化階段。由圖3 可知，鮮切蘋果皮渣黃酮在腸道消化過(guò)程中，呈現(xiàn)先緩慢增加后下降的趨勢(shì)。不同濃度間，腸消化過(guò)程中黃酮含量差異顯著（＜0.05）。高、中、低濃度的蘋果皮渣黃酮粗提物的含量在腸消化2 h 后顯著上升（＜0.05），2～3 h 黃酮含量達(dá)最大值，分別是腸消化開(kāi)始時(shí)（0 h，即胃消化反應(yīng)后但未進(jìn)行腸消化時(shí)）的1.24、1.59、3.15 倍。

如圖4，對(duì)比發(fā)現(xiàn)相同濃度的黃酮粗提液經(jīng)過(guò)相同的胃消化模擬環(huán)境，空白組（即無(wú)胰酶環(huán)境）的粗提液黃酮含量與腸消化液組（有胰酶環(huán)境），均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，腸液消化組的黃酮含量高于空白組。腸消化過(guò)程中，3 h 之前腸消化組黃酮含量高于空白對(duì)照組，且在0、0.5、2.0 h 時(shí)黃酮含量沒(méi)有顯著性差異（＞0.05），3 h 時(shí)腸液消化組顯著高于空白組（＜0.05）。在消化的第3 h左右達(dá)到峰值，后緩慢降低。對(duì)比得出，有胰酶的腸模擬溶液一定程度可以促進(jìn)黃酮釋放。隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，酯鍵可能被水解或部分黃酮降解，因而使黃酮含量在腸消化后端降低。

腸消化過(guò)程中，黃酮釋放量的顯著升高可能是由于部分蛋白質(zhì)在胰酶的作用下水解，使得被大分子蛋白質(zhì)包埋的黃酮類物質(zhì)被釋放出來(lái)；腸液消化組的酶可能作用于結(jié)合態(tài)的黃酮類物質(zhì)，中性或偏堿性黃酮（如槲皮素等）可以在腸液介質(zhì)中釋放，并穩(wěn)定存在。而腸消化后期隨著酸性黃酮（如黃烷-3-醇等）大量降解或發(fā)生異構(gòu)，釋放的黃酮低于降解的黃酮，從而使黃酮總量降低。

2.2 體外模擬消化過(guò)程中鮮切蘋果皮渣黃酮粗提液還原能力的變化

2.2.1 體外模擬胃消化 體外模擬胃消化對(duì)鮮切蘋果皮渣粗提物還原能力的影響見(jiàn)圖5 和圖6。

圖5 體外模擬胃消化對(duì)不同濃度鮮切蘋果皮渣粗提液還原能力的影響Fig.5 Effect of in vitro simulated gastric digestion on the reducing ability of crude extracts of fresh-cut apple residue at different concentrations

圖6 體外模擬胃消化中胃蛋白酶對(duì)鮮切蘋果皮渣粗提液還原能力的影響Fig.6 Effect of pepsin on the reducing ability of fresh-cut apple residue crude extract in vitro simulated gastric digestion

從圖5 可以看出，在模擬胃消化過(guò)程中，其還原能力逐漸升高，并趨于穩(wěn)定，這與黃酮釋放量的變化規(guī)律基本一致。不同濃度間，胃消化過(guò)程中還原力差異顯著（＜0.05），濃度越高，總還原力越強(qiáng)。2 倍稀釋組和4 倍稀釋組在0.5 h 的還原能力就顯著高于0 h（＜0.05），1 倍稀釋組在消化1 h 的還原能力顯著高于0 h（＜0.05）。

由圖6 可知，模擬胃液消化和酸消化后鮮切蘋果皮渣黃酮的總還原力均提高。胃液消化組（pH=2，有胃蛋白酶）和酸對(duì)照組（pH=2，無(wú)胃蛋白酶）的還原能力顯著高于空白對(duì)照組（＜0.05）。胃消化1 h 時(shí)胃液消化組和酸對(duì)照組的總還原力分別是空白對(duì)照組的1.39 倍和1.29 倍。而胃液消化組的還原力在1 h 以后又高于酸對(duì)照組，說(shuō)明酸性條件和胃蛋白酶均有利于鮮切蘋果皮渣黃酮抗氧化活性的發(fā)揮，胃液消化對(duì)還原力的增強(qiáng)能力大于酸消化。可能是由于結(jié)合型黃酮類物質(zhì)在體外經(jīng)酸水解、酶水解等方式破壞酯鍵、醚鍵等得以釋放，使其表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性（還原性），因此消化后具有較高的保健價(jià)值。

2.2.2 體外模擬腸消化 體外模擬腸消化對(duì)鮮切蘋果皮渣黃酮粗提物還原能力的影響見(jiàn)圖7 和圖8。圖7 所示，模擬腸道消化環(huán)境中，隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，各組還原能力呈先增加再降低的趨勢(shì)。腸消化1 h 以內(nèi)，三組濃度的總還原力均無(wú)顯著變化，各濃度之間還原力差異顯著（＜0.05），在消化2～3 h時(shí)，各組樣品均呈現(xiàn)還原能力增強(qiáng)的趨勢(shì)；鮮切蘋果皮渣黃酮粗提液濃度越大，其還原能力也隨之增大。

圖7 體外模擬腸消化對(duì)不同濃度鮮切蘋果皮渣粗提液還原能力的影響Fig.7 Effect of in vitro simulated intestinal digestion on the reducing ability of crude extracts of fresh-cut apple residue at different concentrations

圖8 體外模擬腸消化中胰酶對(duì)鮮切蘋果皮渣粗提液還原能力的影響Fig.8 Effect of pancreatic enzymes on the reducing ability of fresh-cut apple residue crude extract in vitro simulated intestinal digestion

由圖8 中可以看出，整個(gè)腸消化過(guò)程中，腸液消化組（有胰酶）的還原能力一直高于空白組（無(wú)胰酶），且消化1 h 后該趨勢(shì)更為顯著（＜0.05）。腸液消化組還原力呈現(xiàn)先升高后降低并趨于平穩(wěn)，而空白組的還原能力1 h 后略有升高，3 h 后顯著下降（＜0.05），說(shuō)明胰酶對(duì)鮮切蘋果皮渣黃酮的還原能力有一定的增強(qiáng)作用。

黃酮類化合物以黃烷為母核，羥基的數(shù)量和位置都極大地影響了其抗氧化能力。蘋果果實(shí)類黃酮達(dá)34 種，分屬黃烷醇、黃酮醇、花青苷、二氫查耳酮和二氫黃酮醇5 類，總還原力的變化可能與黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及含量的變化有關(guān)，胃腸環(huán)境的變化也影響黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的發(fā)揮。另外，抗氧化活性也是體系中所有抗氧化物質(zhì)發(fā)揮協(xié)同和拮抗作用的結(jié)果。

3 結(jié)論

在模擬胃、腸消化過(guò)程中，鮮切蘋果皮渣黃酮釋放量均有顯著升高（＜0.05），還原能力增強(qiáng)。在模擬胃消化中，胃蛋白酶和酸性環(huán)境對(duì)黃酮的釋放和黃酮還原力均有促進(jìn)作用，鮮切蘋果皮渣黃酮粗提液濃度越大，還原力也越大；在模擬腸消化中，胰酶可以在一定程度上促進(jìn)黃酮的釋放，同時(shí)對(duì)還原能力也有增強(qiáng)作用，且鮮切蘋果皮渣黃酮粗提液濃度越大，腸道中黃酮的還原力也越大。

任何一種生物活性物質(zhì)在發(fā)揮其作用之前，都要經(jīng)過(guò)人體的胃腸道消化，而消化也會(huì)對(duì)黃酮類化合物的生物活性產(chǎn)生影響。通過(guò)體外模擬腸胃消化法可以評(píng)價(jià)鮮切蘋果皮渣在胃腸消化模擬過(guò)程中黃酮含量和其粗提液還原能力的變化規(guī)律。但體內(nèi)環(huán)境相當(dāng)復(fù)雜多變，還受到原料品種、取樣位置等的影響，因此可通過(guò)進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、人體實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行驗(yàn)證探究。