6種殺菌劑對食用菌鏈孢霉的體外抑制作用

劉斌， 董照鋒

(1.陜西省農產品質量安全中心，陜西 西安 710000； 2.商洛市農產品質量安全中心，陜西 商洛 726000)

食用菌以味道鮮美、營養豐富而逐漸成為人們餐桌上常見的健康食品。近年來，隨著我國農業產業結構的調整，食用菌在現代農業生產中的地位和作用越來越明顯。隨著國家環保政策調整和栽培方式的轉變，食用菌產業步入了規模化、工廠化、設施化、標準化的發展軌道。但鏈孢霉在很多香菇、木耳等食用菌生產基地發生，其生長速度快，生活力強，如果處理不及時幾天內就能引起大面積污染，調查中最高污染率達75%，造成重大的經濟損失。國內有不少學者開展了抑制食用菌鏈孢霉的相關研究。趙長江等[1]采用藥劑平板法分析了5種植物源農藥對食用菌鏈孢霉的抑制效果，篩選出乙蒜素和丁子香酚作為其綠色防控的優選植物源農藥。張希等[2]采用平板涂布法考察了15種中藥材提取物對3種食用菌致病菌孢子萌發的影響，認為大蒜、徐長卿、小薊、金銀花、黃柏、土荊皮、石榴皮對鏈孢霉孢子萌發有較好的抑制作用。葉慧麗等[3]測定了4種生物殺菌劑對食用菌鏈孢霉的抑制作用，40 mg·kg-1中生菌素對鏈孢霉菌絲生長抑制率達到100%，而對食用菌菌絲抑制率低于10%。劉釗等[4]開展了6種殺菌劑對鏈孢霉的抑菌效果試驗，認為100倍克霉靈和鏈孢克星對鏈孢霉抑菌作用較好。冀瑞卿等[5]采用生長速率法和懸滴法測定了多黏類芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對食用菌鏈孢霉菌絲和孢子的抑制效果，認為兩種生防制劑可分別作為鏈孢霉孢子和菌絲的抑制劑。李寧芳等[6]采用對比試驗分析食用菌鏈孢霉感染的原因，提出了精準預防、過程控制的一般污染和嚴重污染的控制對策。朱富春[7]提出了樹立防治意識、推選優質菌種、搞好環境衛生、嚴格栽培操作、合理化學防治的綜合措施以防控食用菌鏈孢霉的為害。賈含琪[8]從土壤中篩選出一株對鏈孢霉有良好抑制作用的真菌，將其90%乙醇洗脫物稀釋成有效濃度為45%的制劑，用量為400 μL·mL-1時可有效抑制危害。為了篩選安全高效的防治藥劑，本研究選取微生物源農藥、抗生素類農藥和化學農藥3大類6種藥劑開展食用菌鏈孢霉的體外抑制試驗，同時考察其對食用菌菌絲生長的影響，以期為食用菌生產中鏈孢霉的化學防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

430 g·L-1戊唑醇懸浮劑(鹽城利民農化有限公司)；100億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌粉劑(陜西鼎微生物科技有限公司)；0.15%四霉素水劑(遼寧微科生物工程股份有限公司)；2%春雷霉素水劑、3%多抗霉素水劑(績溪農華生物科技有限公司)；40%多菌靈懸浮劑(江蘇劍牌農化股份有限公司)；0.05 mol·L-1HCl(國藥集團化學試劑有限公司)。

供試菌株于2020年春季在商洛市福眾嶺農業有限責任公司香菇基地采集，經實驗室分離鑒定，連續純化兩代后接種在PDA試管斜面培養基，并置于4 ℃保存備用。

1.2 處理設計

試驗設7個處理，每個處理3次重復，每種殺菌劑的試驗濃度參考使用說明推薦用量。A：430 g·L-1戊唑醇懸浮劑90 μg·mL-1；B：100億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌粉劑500萬芽孢·mL-1；C：0.15%四霉素水劑 2.0 μg·mL-1；D：2%春雷霉素水劑100 μg·mL-1；E：3%多抗霉素水劑60 μg·mL-1；F：40%多菌靈懸浮劑 1 000 μg·mL-1；CK：清水對照。

1.3 試驗方法

采用菌絲生長速率法[9-10]和孢子萌發法[11-12]分別測定6種供試藥劑對菌絲生長和孢子萌發的抑制效果。

含藥培養基的制備及菌絲接種：將馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基定量分裝于100 mL三角瓶中，121 ℃滅菌40 min，水浴鍋冷卻至50 ℃，分別加入6種供試藥劑，充分混合均勻后取10 mL注入滅菌的9 cm培養皿中制成試驗濃度的藥劑平板，以等量無菌水培養基作空白對照。在PDA培養基活化菌株的菌落生長旺盛處用打孔器取直徑6 mm的菌碟，每皿平板培養基放入1塊菌碟至中心位置，置于25 ℃、90%相對濕度下培養，分別于20、24 h用十字交叉法測量各皿菌落直徑，計算菌絲生長擬制率。菌絲生長擬制率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)÷(對照菌落直徑-菌碟直徑)]×100%。

孢子懸浮液的制備及接種：50 mL無菌水加入0.05 mol·L-1HCl 2 mL備用。選取培養2～3 d已產生分生孢子的平板1～2皿，在無菌條件下加入10 mL上述制備液體，用接種鏟輕刮菌落表面，在已滅菌的口徑7 cm漏斗上加1層擦鏡紙，將孢子懸浮液過濾在已滅菌的50 mL錐形瓶內，并加滅菌的棉塞。取1～2滴孢子懸浮液在顯微鏡下觀察孢子量，以加入適量滅菌水調節孢子濃度至每個視野80～100個孢子為宜。在藥劑平板培養皿背面用記號筆畫3個小圈標記孢子懸浮液滴入點位置以便觀察，3個點呈三角形排列，每點滴1滴孢子懸浮液。以等量無菌水培養基作空白對照。將各處理置于25 ℃、90%相對濕度下培養6～8 h，在對照組孢子萌發80%～90%時將對應處理組全部取出放入4 ℃冰箱冷藏，終止孢子繼續萌發并逐一鏡檢，統計各處理孢子萌發情況。

孢子萌發率=(孢子萌發數量÷觀察孢子數量)×100%；孢子萌發抑制率=[(對照孢子萌發率-處理孢子萌發率)÷對照孢子萌發率]×100%。

2 結果與分析

2.1 6種藥劑對菌絲生長的抑制作用

6種供試殺菌劑對食用菌鏈孢霉菌絲抑制率均在60%以上，具有較好的抑菌作用(表1、圖1)。其中，處理F和A抑菌作用較好，20 h抑制率分別為95.5%和90.3%，24 h抑制率分別為95.6%和91.5%，24 h較20 h的抑制率略有增加。處理B、C、D、E在20 h時的抑制率分別為73.9%、79.5%、62.6%和63.5%，24 h時抑制率分別為72.0%、81.4%、62.3%和60.6%。20 h和24 h處理F和處理A之間、處理D和處理E之間差異不顯著。處理C和處理B于20 h差異不顯著，與其他處理之間差異顯著。24 h時所有處理之間差異均極顯著。

表1 6種殺菌劑對菌絲的抑制作用

圖1 6種殺菌劑對食用菌鏈孢霉菌絲24 h抑制效果

2.2 6種藥劑對分生孢子的抑制作用

接種后8 h觀察孢子萌發情況，CK萌發率達到75.1%，處理A、C和F抑制率分別為100%、99.9%和71.5%(表2)，處理A與處理C差異不顯著，而與處理F差異顯著。其他處理對孢子萌發的抑制作用較差，與CK無顯著差異。

表2 6種殺菌劑對分生孢子的抑制作用

3 小結與討論

因四霉素外其他5種供試農藥是《綠色食品 農藥使用準則》[13]推薦使用的農藥，所以本研究未考察6種殺菌劑對食用菌菌絲的安全性。在2021年12月下旬的栽培試驗中，我們通過栽培基質加標的方法考察了供試農藥對木耳菌絲生長的影響，截至2022年3月20日菌包發菌結束，供試農藥并未對菌絲產生明顯的影響。在選用食用菌殺菌劑時，應盡量選擇對孢子萌發抑制作用強，而對菌絲抑制率較低的藥劑。

供試6種殺菌劑對食用菌鏈孢霉菌絲皆有抑制效果，40%多菌靈懸浮劑 1 000 μg·mL-1和430 g·L-1戊唑醇懸浮劑 90 μg·mL-1對鏈孢霉菌絲抑制效果顯著，其次是0.15%四霉素水劑 2.0 μg·mL-1和100億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌粉劑 500萬芽孢·mL-1，2%春雷霉素水劑 100 μg·mL-1和3%多抗霉素水劑 60 μg·mL-1的抑制率也達到60%以上。430 g·L-1戊唑醇懸浮劑 90 μg·mL-1、0.15%四霉素水劑 2.0 μg·mL-1、40%多菌靈懸浮劑 1 000 μg·mL-1對鏈孢霉分生孢子具有較好的抑制作用，接種后8 h 430 g·L-1戊唑醇懸浮劑 90 μg·mL-1處理的分生孢子無一萌發，0.15%四霉素水劑 2.0 μg·mL-1的抑制率高達99.9%，40%多菌靈懸浮劑 1 000 μg·mL-1的抑制率達到71.5%。綜上所述，食用菌鏈孢霉宜選用戊唑醇、多菌靈和四霉素進行防治，濃度參考推薦使用量。