百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽保護單側輸尿管梗阻大鼠腎纖維化的機制探究

朱戈麗，李菊霜，喻業安，封寶紅，畢智敏，伍 軍

每年因慢性腎臟病發展為終末期腎病的患者數持續增加[1]。慢性腎臟病發病早期癥狀較為隱匿，且病情輕微，易被患者忽視，是終末期腎病發病率持續增長的原因[2]。腎纖維化是慢性腎臟病進入終末期的主要病理基礎，且纖維化程度與腎功能水平密切相關[3]。故改善腎纖維化是降低終末期腎病發生的重要環節。據報道，百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽可明顯改善單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎纖維化[4]，但其潛在作用途徑尚不清楚。百令膠囊常作為天然蟲草的代用品，具有保護肝腎功能、拮抗氧自由基的作用[5]。還原型谷胱甘肽可發揮抗脂質過氧化作用以減輕自由基損傷[6]。本研究從氧化應激方面著手，探究百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽保護UUO模型大鼠腎纖維化的機制，以期為其臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 清潔級SD大鼠40只，雄性，體質量220～260 g，8周齡，由武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(鄂)2017-0012。將大鼠隨機分為假手術組、UUO組、還原型谷胱甘肽組及百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽組(聯合組)，每組10只。

1.2UUO模型構建[7]與給藥 各組大鼠禁食、禁水12 h，麻醉后于左側腹部偏下處切開，逐層打開腹腔，游離出跨過左側髂血管的左側輸尿管，除假手術組外的其他組大鼠于左側輸尿管腎盂結合處及向下1 cm處完全結扎，再逐層縫合關閉腹腔。于造模前1 d至術后第9日還原型谷胱甘肽組予還原型谷胱甘肽(重慶藥友制藥有限責任公司，國藥準字H2010093)300 mg/kg灌胃，聯合組予百令膠囊(杭州中美華東制藥有限公司，國藥準字Z10910036)1.5 g/kg和還原型谷胱甘肽300 mg/kg灌胃，每日1次。假手術組和UUO組予等量生理鹽水。

1.3檢測指標及方法 給藥結束后，稱量大鼠體質量，注射戊巴比妥麻醉大鼠，腹主動脈取血，分離血清采用全自動生化分析儀測定血肌酐(Scr)和尿素(BUN)。剪取左側腎組織，稱梗阻側腎臟濕重，計算腎臟指數[梗阻側腎臟濕重/體質量×100%]。經左側腎臟冠狀面剪取部分腎組織固定于甲醛溶液制備石蠟切片，分別行常規HE染色和Masson染色，觀察大鼠腎組織病理變化。剪取腎皮質，混入預冷生理鹽水制備組織勻漿液，采用ELISA法檢測活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。剩余腎組織添加RIPA裂解液提取總蛋白，蛋白定量后行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再電轉至聚偏二氟乙烯膜，經5%脫脂牛奶室溫封閉后分別添加兔抗Nrf2、Keap1多克隆抗體及小鼠抗β-actin單克隆抗體，4 ℃過夜孵育，1︰1000稀釋，TBST洗膜5次，每次8 min，再加入二抗室溫孵育1 h，1︰5000稀釋，TBST洗膜5次，每次8 min，最后顯影曝光。掃描X線片條帶，使用Image J軟件測定條帶灰度值，目的蛋白與β-actin蛋白灰度值表示該目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽對UUO大鼠腎功能的影響 與假手術組比較，UUO組血清Scr、BUN和梗阻側腎臟指數明顯升高(P<0.05)；與UUO組比較，還原型谷胱甘肽組和聯合組Scr、BUN和梗阻側腎臟指數明顯降低，且聯合組降低效果更顯著(P<0.05)。見表1。

表1 百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽對UUO大鼠腎功能的影響

2.2百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽對UUO大鼠腎組織病理形態的影響 HE染色顯示，假手術組腎組織細胞結構正常；UUO組腎小管擴張、上皮細胞腫脹明顯，伴空泡征和大量炎性細胞浸潤；還原型谷胱甘肽組和聯合組上述病理改變明顯減輕。Masson染色顯示，假手術組基本無藍色膠原纖維，UUO組腎間質存在大量的藍色膠原纖維，還原型谷胱甘肽組和聯合組膠原纖維量明顯減少。

2.3百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽對UUO大鼠腎組織氧化應激的影響 與假手術組比較，UUO組腎組織勻漿液中ROS和MDA含量明顯升高，SOD含量明顯降低(P<0.05)；與UUO組比較，還原型谷胱甘肽組和聯合組ROS和MDA含量明顯降低，SOD含量明顯升高，且聯合組改善效果優于還原型谷胱甘肽組(P<0.05)。見表2。

表2 百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽對UUO大鼠腎組織氧化應激的影響

2.4百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽對UUO大鼠腎組織Nrf2和Keap1蛋白表達的影響 與假手術組比較，UUO組腎組織中Nrf2蛋白表達明顯降低，Keap1蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與UUO組比較，還原型谷胱甘肽組和聯合組Nrf2蛋白表達明顯升高，Keap1蛋白表達明顯降低，且聯合組改善效果優于還原型谷胱甘肽組(P<0.05)。見表3。

表3 百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽對UUO大鼠腎組織Nrf2和Keap1蛋白表達的影響

3 討論

目前，慢性腎臟病的治療多采用多模式治療，包括應用阻斷腎素-血管緊張素系統、嚴格控制血壓血糖藥物等，但目前終末期腎病的逆轉效果仍十分有限[8]。故迫切需要更為有效的治療方法，減緩或阻止慢性腎臟病的進展。尿路阻塞導致腎腫大，尿液聚集于腎盂或腎盞，腎結構會出現進行性損傷，從而引起慢性腎功能障礙。隨著腎血流量、腎小球濾過率逐漸降低，腎實質損傷也進一步加重，腎小管萎縮和細胞外基質沉積，這將加速腎纖維化[9]。故UUO是研究腎纖維化的理想模式。本研究結果顯示，UUO大鼠梗阻側腎臟出現明顯水腫，腎小管間質損傷嚴重，并伴明顯纖維化，腎功能也出現明顯障礙，提示UUO大鼠模型構建成功。

百令膠囊可補肺腎、益精氣，常用于肺腎兩虛引起的咳嗽、氣喘、慢性腎功能不全的輔助治療[10-13]。于文會等[14]發現，聯用氯沙坦鉀片和百令膠囊治療慢性腎臟病可以改善患者腎功能，減輕腎小球硬化，延緩腎纖維化。還原型谷胱甘肽主要由肝臟合成，可與體內過氧化物和自由基結合，保護細胞中含巰基的蛋白質和酶，可參與多種外源性、內源性有毒物質的減毒反應[15-16]。許誠楷等[17]發現，應用還原型谷胱甘肽治療可顯著改善早期糖尿病慢性腎臟病患者免疫功能、氧化應激水平，減少異常新生血管生成。百令膠囊加還原型谷胱甘肽含藥血清可能通過抑制TGF-β1/Smad表達,抑制腎纖維化[18]。本研究顯示，百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽治療后大鼠腎組織病理損傷和腎纖維化程度明顯減輕，腎功能也有明顯改善，與上述研究結果相符。

氧化應激在腎纖維化的發生發展中起重要作用，過度分泌ROS可氧化或損傷DNA、蛋白質和脂質，致腎功能損傷[19-20]。本研究結果顯示，UUO大鼠ROS和MDA含量明顯升高，SOD含量明顯下降，經百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽治療后，ROS和MDA含量明顯下降，SOD含量明顯升高，提示百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽可能通過降低氧化應激水平，改善UUO大鼠腎纖維化。Nrf2是調節抗氧化應激反應的轉錄因子，而Keap1是Nrf2特異性受體，正常狀態下Nrf2與Keap1形成聚合物處于無活性狀態，氧化應激刺激下聚合物解離啟動抗氧化反應元件[21]。大量研究顯示，調控Nrf2/Keap1信號通路，可能是改善腎損傷的潛在作用途徑[22]。本研究UUO大鼠腎組織中Nrf2表達下調，Keap1表達上調，給予百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽干預后Nrf2表達上調，Keap1表達下調，提示百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽可能通過調節Nrf2/Keap1信號通路，降低氧化應激水平，發揮對UUO大鼠腎纖維化保護作用。

綜上，百令膠囊聯合還原型谷胱甘肽可明顯減輕UUO大鼠腎纖維化，可能與通過調節Nrf2/Keap1信號通路減輕氧化應激有關。