超高效液相色譜法測定羅漢果中7種成分含量*

彭可壟，彭晴菲，劉林慧，尹春萍

(1.重慶藥友制藥有限責任公司，重慶 401121；2.華中科技大學同濟醫學院藥學院，武漢 430030)

羅漢果為葫蘆科植物羅漢果Siraitiagrosuenorii(Swingle)的干燥果實，性甘，涼，歸肺、大腸經，功能為清熱潤肺，利咽開音，滑腸通便，用于肺熱燥咳，咽痛失音，腸燥便秘[1]。目前，國家藥品監督管理局批準的羅漢果相關藥品文號數量有100多個，應用廣泛。羅漢果中葫蘆素類化合物具有抗腫瘤、抗炎、調節免疫、保肝、降血糖以及抗心肌肥大等多種藥理作用，主要用于治療腫瘤、肝臟疾病、炎癥、糖尿病和心血管疾病等[2-5]。此外，羅漢果皂苷Ⅴ還可作為難溶性藥物的載體，起到增溶作用[6]。研究表明[7]，除羅漢果皂苷Ⅴ外，羅漢果苷Ⅱe、羅漢果苷Ⅲe、羅漢果苷Ⅳe、11-O-羅漢果苷Ⅱe和羅漢果苷Ⅲ等化學成分有望成為羅漢果質量標志物(quality marker，Q-Marker)。羅漢果現行質量標準為《中華人民共和國藥典》2020年版一部收載的標準，含量測定中僅對羅漢果皂苷Ⅴ進行控制，未對其他羅漢果苷類物質進行控制。YAN等[8]報道一種采用飛行時間質譜法測定5種羅漢果苷成分的方法，但該方法采用飛行時間質譜進行含量測定，不適合作為常規的控制手段。為了能對羅漢果的其他成分進行準確測定，進而為提高藥品質量標準奠定基礎，需要一個可以同時測定羅漢果中多種成分的分析方法。高效液相色譜法特別是超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography，UPLC)由于具有柱效高，分離速度快的優勢，在中藥含量檢測中的應用越來越廣泛[9]。筆者在本文建立UPLC法，可同時檢測羅漢果中的7種成分，為羅漢果藥材及制劑的質量研究和控制提供可靠的分析方法。報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Agilent 6460 LC-MS/MS三重四極桿質譜儀(美國安捷倫公司)；ME204E型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司，感量：0.1 mg)；XP26型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司，感量：0.001 mg)；KQ500D型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TG-16高速離心機(四川蜀科儀器有限公司)；Waters BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)。

1.2藥品與試劑 羅漢果皂苷V(含量：96.1%，中國食品藥品檢定研究院，批號：111754-202104)；羅漢果對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121020-201807)；羅漢果對照藥材(北京萬佳標準物質研究中心，批號：LG30025)；11-O-羅漢果苷Ⅴ( 含量：98%，批號：PRF7102401)，賽門苷Ⅰ(含量：98%，批號：PRF21012041)，羅漢果苷Ⅳ(含量：98%，批號：PRF20082144)，羅漢果苷Ⅲ(含量：98%，批號：PRF9013305)，羅漢果苷Ⅲe(含量：98%，批號：PRF10050641)，羅漢果苷Ⅱe(含量：98%，批號：PRF10083041)，均購自成都普瑞法科技開發有限公司；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純；羅漢果藥材來源于多個不同產地，經華中科技大學同濟醫學院藥學院尹春萍副教授鑒定為羅漢果原果。

2 方法與結果

2.1色譜與質譜條件 以Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)為色譜柱；進樣量為1 μL；柱溫為35 ℃；紫外檢測波長為203 nm；以水-乙腈(80：20)為流動相A，以水-乙腈(10：90)為流動相B， 梯度洗脫(0～2 min 100%A，2～10 min 100%A→90%A，10～11 min 90%A，11.01～16 min 100%B，16.01～18 min 100%A)；流速為每分鐘0.3 mL。質譜定性鑒別采用電噴霧離子化源(electrospray ionization，ESI)；離子監測模式為選擇離子監測(selected ion monitoring，SIM)；監測的離子為1307.8，1309.8，1147.8，1147.8，985.7，985.7和823.7；干燥氣溫度 300 ℃；干燥氣流速為每分鐘10 L；霧化氣壓力為50 psi；鞘氣溫度為300 ℃； 鞘氣流速為每分鐘10 L；傳輸毛細管電壓3500 V； 噴嘴電壓1000 V。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 分別精密稱取11-O-羅漢果苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe、羅漢果苷Ⅱe對照品適量，用水-甲醇(40：10)溶解并稀釋制成含羅漢果皂苷Ⅴ對照品濃度為50 μg·mL-1的溶液，其他對照品為5 μg·mL-1混合溶液，作為對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 將羅漢果原藥材粉碎后，稱取藥材粉末約0.25 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，精密加入水40 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)40 min，取出，放冷，用甲醇定容，搖勻，取適量，13000 r·min-1(離心半徑r=3 cm)離心5 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.3方法學驗證

2.3.1紫外光譜和質譜行為表征 稱取各對照品適量，精密稱定，用水-甲醇(40：10)溶解并定量稀釋制成含各組分濃度約為0.1 mg·mL-1的混合對照品溶液，進樣分析，采用二極管陣列檢測器和質譜檢測器進行檢測，進行各組分的紫外吸收光譜(ultraviolet absorption spectra，UV)和質譜母離子掃描。采集各對照品主峰的UV光譜，各成分吸收峰波長在193 nm。為避免低波段較大的干擾，因此參考《中華人民共和國藥典》2020年版(一部)羅漢果藥材標準，選擇波長203 nm為檢測波長；母離子掃描質譜各組分均為[M+Na]+峰，質荷比分別為1307.8，1309.8，1147.8，1147.8，985.7，985.7和823.7，采用選擇離子監測模式對上述離子進行檢測。

2.3.2專屬性實驗 分別進樣空白溶液(水-甲醇40：10)、混合對照品溶液和羅漢果藥材溶液，記錄色譜圖，結果11-O-羅漢果苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe、羅漢果苷Ⅱe依次出峰，空白溶劑對測定無干擾。色譜圖見圖1。

2.3.3檢測限和定量限 精密稱取對照品適量，用水-甲醇(40：10)配制各組分濃度約為0.5 μg·mL-1和0.25 μg·mL-1的混合對照品溶液，作為定量限(limit of quantitation，LOQ)和檢測限(limit of detection，LOD)溶液，進樣分析，計算各色譜峰的信噪比，定量限溶液色譜圖中各色譜峰的信噪比均>10，檢測限溶液色譜圖中各色譜峰的信噪比均>3。

2.3.4線性關系考察 精密稱取各對照品適量，用水-甲醇(40：10)配制成不同濃度的混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定各組分的峰面積，以峰面積(A)為縱坐標，質量濃度(C)為橫坐標進行回歸，并計算各成分相對羅漢果苷Ⅴ的校正因子：校正因子=羅漢果苷Ⅴ線性斜率÷其他組分線性斜率。結果見表1。結果表明11-O-羅漢果苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe和羅漢果苷Ⅱe在各自范圍內線性關系良好。

2.3.5精密度實驗 取對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下，重復進樣6次，記錄色譜圖，計算色譜圖中11-O-羅漢果苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe和羅漢果苷Ⅱe峰面積的RSD，結果分別為1.9%，1.6%，1.7%，0.6%，1.8%，1.5%和1.9%。

2.3.6穩定性實驗 精密吸取羅漢果藥材同一份供試品溶液，于0，13，23和24 h進樣檢測各組分的峰面積，計算峰面積的RSD，11-O-羅漢果苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe和羅漢果苷Ⅱe峰面積的RSD分別為0.6%，1.3%，1.2%，1.1%，1.3%，1.2%和2.1%，供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.7重復性實驗 分別取同一批次羅漢果對照藥材，按照“2.2.2”項下方法制備6份供試品溶液，依法進樣測定11-O-羅漢果苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe和羅漢果苷Ⅱe的峰面積，計算得7種成分含量的RSD分別為1.7%，1.3%，2.0%，2.3%，2.2%，2.2%，1.5%。

2.3.8回收率實驗 稱取羅漢果對照藥材0.25 g，按照“2.2.2”項下制備供試品溶液并測定含量，作為原有量，平行測定3份，計算各組分原有量的平均值；另精密稱取各對照品適量，用水稀釋制成含羅漢果皂苷Ⅴ濃度為5 mg·mL-1的溶液(儲備液A)，11-O-羅漢果苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ濃度為0.125 mg·mL-1的混合對照品溶液(儲備液B)，羅漢果苷Ⅲe和羅漢果苷Ⅱe濃度為0.125 mg·mL-1的混合對照品溶液(儲備液C)作為回收率儲備液。分別稱取9份羅漢果對照藥材0.25 g，每3份為一組，作為低、中、高濃度組，分別加入儲備液A 0.25 ，0.5和1 mL(相當于羅漢果皂苷Ⅴ含量為0.5%，1.0%和2.0%)，儲備液B 0.2，2和8 mL(相當于11-O-羅漢果苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ和羅漢果苷Ⅲ含量為0.01%，0.1%和0.4%)，儲備液C 0.2，1和2 mL(相當于羅漢果苷Ⅲe和羅漢果苷Ⅱe含量為0.01%，0.05%和0.1%)，用水補足至40 mL，照“2.2.2”項下制備供試品溶液并按照各組分的對照品外標法進行測定，計算測得量，按下式計算回收率，回收率(%)=(測得量-原有量均值)/加入量×100%。分別計算平均回收率和RSD，結果見表2。另將回收率溶液色譜圖中除羅漢果皂苷Ⅴ外其他組分的峰面積乘以按照表1中的校正因子后，用羅漢果皂苷Ⅴ對照品溶液按加校正因子的外標法測定各組分含量，計算平均值，結果對比見表3。

A.空白溶劑UV色譜圖；B.混合對照UV色譜圖；C.對照藥材UV色譜圖；D.羅漢果藥材UV色譜圖；E.混合對照SIM色譜圖；F.對照藥材SIM色譜圖；1.11-O-羅漢果苷Ⅴ；2.羅漢果皂苷Ⅴ；3.賽門苷I；4.羅漢果苷Ⅳ；5.羅漢果苷Ⅲ；6.羅漢果苷Ⅲe；7.羅漢果苷Ⅱe。

表1 7種成分線性關系與范圍及校正因子

2.3.9相對保留時間的考察 以羅漢果皂苷Ⅴ峰為參照，分別考察不同條件下各組分的相對保留時間，包括調整流速為0.28和0.32 mL·min-1、柱溫為33和37 ℃、A相為水-乙腈78：22(比例1)和82：18(比例2)，結果見表4。

2.3.10樣品測定結果 取26批羅漢果藥材進行測定，計算各組分的含量，結果見表5。

3 討論

3.1檢測指標成分的選擇 在《中華人民共和國藥典》2020年版一部羅漢果藥材標準中，采用羅漢果皂苷Ⅴ 作為羅漢果的含量指標，限度為不低于0.5%。該指標單一，無法全面反映羅漢果的藥材質量。羅漢果中尚含有11-O-羅漢果苷Ⅴ，賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe及羅漢果苷Ⅱe等，因此，本文選擇羅漢果皂苷Ⅴ等7種成分作為指標，進行羅漢果質量的考察。

3.2提取溶劑及提取方式的考察 《中華人民共和國藥典》2020年版一部收載羅漢果含量測定方法，采用回流提取的方式進行提取。筆者分別考察水、甲醇、乙醇、異丙醇等不同溶劑，超聲和回流提取等不同提取方式，以及不同溶劑體積的提取效果，結果表明以水為提取溶劑，采用超聲提取的方式，即可有效提取出本品中的目標組分，相比《中華人民共和國藥典》收載的提取方法簡單易行。

表2 7種成分回收率實驗結果

表3 兩種定量方式的測定結果比較

表4 6種成分相對保留時間的考察結果

3.3色譜條件的選擇

3.3.1流動相的選擇 由于各組分均為低波長吸收，因此采用截止波長較低的乙腈作為有機相；另外，為使流動相可兼容質譜分析，實現對目標組分進行準確定性，并為后續采用高分辨質譜對更多的其他未知組分進行結構鑒定預留空間，因此流動相中未添加不揮發性的緩沖鹽。同時，由于甲酸、乙酸等揮發性緩沖鹽在低波長下背景噪音較高，掩蓋目標組分的色譜峰，因此也未使用。本文選用簡單的乙腈-水體系作為流動相體系，各組分峰型良好。

在采用該流動相體系進行質譜分析時，出現信號很強的[M+Na]質譜信號峰，[M+H]信號峰極弱，且在進行碎片離子掃描時，碎片離子不明顯，可能的原因是由于各組分無明顯的酸堿基團，在ESI電離源下很難形成[M+H]或[M-H]信號，反而出現了較強的[M+Na]信號峰，而碎片離子也同樣由于沒有穩定的帶電形式，質譜信號較弱。

3.3.2色譜柱和梯度的選擇 本試驗首先采用Agilent SB C18(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)色譜柱，以高比例的水相作為起始比例，進行梯度洗脫，通過調整梯度變化速率以實現各組分的分離，但運行時間較長，因此選擇柱效更好的超高效液相色譜柱，通過進一步優化梯度，建立了本方法。

3.3.3定量方式的選擇 本文除采用對照品外標法進行含量測定外，尚測定各組分相對于羅漢果皂苷V的相對保留時間及校正因子，并對比采用對照品外標法和校正因子法測定結果的差異，結果表明兩種計算方式的差異在10%以內，差異較小。因此，當實驗室完成方法確認后，可按照相對保留時間對各組分進行定位，采用校正因子法對含量進行測定，節約對照品的使用。

3.4檢測結果的分析 本文檢測26種不同廠家和批次的羅漢果藥材，其中羅漢果皂苷Ⅴ的含量最高，除批次R外，均能滿足《中華人民共和國藥典》2020年版一部收載的羅漢果標準的要求；11-O-羅漢果苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ和羅漢果苷Ⅳ均在定量限0.01%以上，最小值為0.02%；羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅲe和羅漢果苷Ⅱe有部分樣品低于0.01%，整體含量較低；11-O-羅漢果苷Ⅴ、羅漢果皂苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅳ和羅漢果苷Ⅲ的測定結果與文獻[8]的測定結果趨勢基本一致，表明本方法測定結果準確可靠。基于26批次藥材的檢測結果，可以考慮將11-O-羅漢果苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ和羅漢果苷Ⅳ增訂入羅漢果藥材的質量標準。另外，各組分的總量除K和R外，均>1%，也可酌情將總量訂入質量標準。

表5 26批羅漢果藥材中7種成分的含量測定結果

筆者采用超高效液相色譜法，對羅漢果中7種組分進行測定，建立羅漢果中多組分的檢測方法，有助于藥品生產企業不斷完善本品的質量標準，從藥材的產地、種屬、采收季節等方面全面研究羅漢果藥材的質量情況，以達到有效成分含量最高，臨床療效最優的目標。本文建立的羅漢果中多組分的分析方法，時間短，專屬性強，靈敏度高，為羅漢果藥材的質量控制與標準提高提供了一定的指導意義。