低溫微創冷凍減脂動物模型的構建

胡大利，曹衛紅，朱莉莉，仇靈江，林威鋼，蔡衛超，楊霖璟，葉超

溫州醫科大學附屬臺州醫院 整形美容科，浙江 臺州 317000

脂肪組織分皮下脂肪組織（subcutaneous adipose tissue, SAT）和內臟脂肪組織（visceral adipose tissue, VAT），它們在形態學和功能學上均存在明顯差異。全身過多的脂肪堆積容易導致肥胖、胰島素抵抗、血脂代謝紊亂、糖尿病和心血管疾病[1]。局部脂肪堆積可影響患者的輪廓及外觀，給 部分患者產生自卑等心理問題[2]。近年來隨著微創美容技術的發展，冷凍減脂技術越來越多地為大眾所接受。然而，因缺乏脂肪微創冷凍減脂模型，所以鮮有冷凍減脂和脂肪冷損傷的相關分子機制的研究。雖已有學者通過冰漿注入豬皮下脂肪研究冰漿減脂療效[3]，但因冰漿本身成分復雜，難以作為微創冷凍減脂的基礎實驗模型。本研究擬通過不同低溫探針干預條件下，造成SD大鼠腹股溝區皮下脂肪局部冷損傷，以期建立合適的脂肪微創冷凍減脂動物模型，并初步探討脂肪冷損傷的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性SD大鼠180只，鼠齡6～8周，體質量（250±50）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005。動物飼養場所為浙江省臺州醫院實驗動物中心，兩鼠一籠飼養，嚴格按照SPF級大鼠飼養要求飼養，實驗期間自由飲水攝食。所有動物實驗操作均遵循 《實驗動物管理條例》以及醫院實驗動物中心的操作指南，同時經醫院動物倫理委員會審核批準。

1.1.2 實驗試劑及儀器：組織包埋機、全自動組織脫水機、石蠟切片機購自英國Shandon公司；熒光顯微成像系統購自日本Olympus公司；光學顯微鏡、倒置熒光顯微鏡購自日本尼康公司。NF-κB-P65及TGF-β1抗體購自美國Abcam公司；TNUEL試劑盒購自杭州諾揚生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及模型建立：180只大鼠隨機分為低溫組（0 ℃組、-20 ℃組、-40 ℃組、-60 ℃ 組、-80 ℃組）以及室溫對照組（Control組），每組30只。腹腔注射0.6%水合氯醛溶液（0.3 mL/100 g） 麻醉后，訂制4 mm直徑探針[4]穿刺入腹股溝區皮下脂肪中層。電子控溫條件下建立穩定的液氮冷凍式探針觸點溫度，可控點溫度為（0±0.56）℃、 （-20± 1.86）℃、 （-40±2.08）℃、 （-60±2.56）℃、 （-80± 2.15）℃。在室溫、0 ℃、-20 ℃、-40 ℃、-60 ℃、 -80 ℃不同溫度條件下，探針接觸右側腹股溝皮下局部脂肪時間為30 s，左側腹股溝接觸時間為 60 s[4]，原理見圖1。干預完后放回飼養籠內，自由飲水攝食。

圖1 液氮冷凍式探針原理圖

1.2.2 動物大體觀察及影像學觀察：干預前、干預后（1 d、3 d、2周、4周、6周）觀察干預前后實驗部位局部皮膚情況并稱取體質量，抽血檢測血脂和肝功能，并行超聲檢測相同部位低溫干預前后雙側腹股溝皮下脂肪厚度。

1.2.3 蘇木精-伊紅（HE）染色：不同溫度（室溫、0 ℃、-20 ℃、-40 ℃、-60 ℃、-80 ℃）干預后，各觀察時間點取6只大鼠，提取雙側腹股溝皮下脂肪，每個樣本一部分液氮冷凍，一部分置于10%中性甲醛固定24 h以上。樣本脫水，將脫水后的組織浸蠟15 min并包埋；蠟塊固定在病理切片機上連續切片；60 ℃烤片50 min后，依次放入二甲苯I、甲苯II溶液、梯度乙醇以及蒸餾水中進行清洗；最后HE染色，脫水封固，光學顯微鏡觀察病理變化。

1.2.4 免疫組織化學染色：脂肪石蠟樣本脫蠟至水，置于抗原修復緩沖液進行抗原修復，10%胎牛血清白蛋白封閉30 min，加入一抗，室溫孵育過夜，加入二抗，室溫下孵育60 min，分別DAB溶液顯色、Mayer蘇木素復染，最后脫水至透明封片，切片于顯微鏡下觀察并采集圖像。應用Image-Pro Plus免疫組化定量掃描分析NF-κB-p65及TGF-β1抗體陽性區域累計光密度值，每張切片分別選取病變區域內的5個高倍視野，計算其平均積分光密度值。

1.2.5 脂肪組織凋亡TUNEL法檢測：各組脂肪組織分別用10%中性甲醛固定，石蠟包理，5 μm厚連續切片后備用。按照TUNEL法檢測試劑盒操作，檢測切片脂肪組織細胞凋亡。

1.3 主要觀察指標 ①大鼠體質量、肝功能、血脂等變化；②大鼠腹股溝皮下脂肪厚度的變化；③局部皮膚及皮下脂肪組織學變化；④局部皮下脂肪組織NF-κB-p65、TGF-β定位及表達情況；⑤局部皮膚皮下脂肪細胞凋亡情況。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS23.0統計軟件進行數據分析，計量數據用±s表示多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建模情況 實驗過程中死亡7只，散在分布于各觀察時間點，無集中現象，存活大鼠均進入結果分析。分析死亡原因與麻醉后低體溫有關：低溫-20 ℃組死亡1只（占3.33%），低溫-40 ℃組死亡1只（占3.33%），低溫-60 ℃組死亡2只（占6.67%），低溫-80 ℃組死亡3只（占10%），符合動物模型構建條件，見表1。

表1 不同溫度干預后各組大鼠死亡情況[只（%）]

2.2 不同溫度干預下大鼠體質量的變化 大鼠蘇醒后飲水攝食正常，不同溫度干預大鼠體質量變化趨勢基本一致。干預3 d后大鼠較少飲食，體質量輕微降低；所有存活大鼠干預6周后體質量明顯增加，與干預前比差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 不同溫度干預下大鼠不同時間點的體質量變化

2.3 不同溫度干預條件下大鼠肝功能和血脂的變化 2組在不同溫度干預條件下血糖、丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、總膽固醇、總膽紅素和白蛋白差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 Control組和-80 ℃組大鼠肝功能和血脂值

2.4 不同溫度干預下大鼠皮膚及組織病理學損傷情況 對照組各觀察時間點大鼠腹股溝皮下脂肪結構完整，無明顯炎癥細胞浸潤。-20 ℃組炎癥細胞浸潤較輕微，皮膚組織未見改變。-60 ℃組干預 60 s 2周后，大鼠腹股溝皮下脂肪炎癥細胞浸潤明顯，較干預30 s 2周后明顯，差異有統計學意義（P＜0.01），但局部皮膚未見紅斑、水腫發生。-80 ℃組干預30 s 2周后除了脂肪組織變化外，皮膚組織開始出現明顯冷損傷表現，60 s 2周后局部損傷更為明顯，見圖3-5。

圖3 不同低溫干預2周后皮膚組織情況

2.5 超聲下不同溫度對大鼠腹股溝皮下干預60 s 6周對脂肪損傷的影響 與術前比，各低溫組（-20 ℃ 組、-40 ℃組、-60 ℃組、-80 ℃組）大鼠腹股溝皮下干預60 s 6周后，大鼠腹股溝皮下脂肪厚度減少量分別為（0.15±0.05）mm、 （0.47±0.05）mm、（0.80±0.06）mm、 （0.85±0.05）mm。隨著干預溫度降低，大鼠腹股溝皮下脂肪厚度減少程度越明顯。與-20 ℃組比，-60 ℃組6周后皮膚無損傷和無皮膚凹陷等情況下大鼠腹股溝皮下脂肪減少程度達到峰值，差異有統計學意義（P＜0.01）。-80 ℃組6周后大鼠腹股溝皮下脂肪凹陷明顯，但脂肪與表皮隔開，可見一陰影區，組織凹陷，見圖6。

圖6 大鼠腹股溝皮下脂肪厚度在不同溫度干預前后變化

2.6 -60 ℃組大鼠脂肪組織NF-κB-p65和TGF-β1的表達量 -60 ℃組干預60 s 2周后和4周后脂肪組織NF-κB-p65蛋白表達量較Control組明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01）；-60 ℃組干預60 s 4周后脂肪組織TGF-β1蛋白表達量較干預2周后和Control組明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖7、圖8。

圖4 大鼠腹股溝皮下脂肪在不同溫度干預30 s、60 s 3 d后組織變化（HE染色，比例尺=50 μm）

圖7 脂肪組織不同溫度干預下NF-κB-p65蛋白免疫組化結果

圖8 脂肪組織不同溫度干預下TGF-β1蛋白免疫組化結果

2.7 不同溫度干預60 s 3 d后對大鼠脂肪細胞凋亡的影響 -20 ℃以下組脂肪細胞隨溫度降低凋亡逐漸增多；與Control組比，-40 ℃組至-80 ℃組干預60 s 3 d后細胞凋亡明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖9。

圖5 大鼠腹股溝皮下脂肪在不同溫度干預30 s、60 s 3 d后炎癥細胞水平

圖9 不同溫度干預3 d后脂肪細胞凋亡水平

3 討論

局部脂肪堆積分為腹部脂肪堆積、大腿脂肪堆積、下頜脂肪堆積、頸部脂肪堆積等[5-6]。脂肪堆積不僅影響人們的身體健康及生活質量，還影響了患者的輪廓及外觀，給部分患者產生自卑等心理問題。目前，微創冷凍溶脂技術逐漸引起大家的關注。通過PubMed、中國知網、萬方等數據庫搜索冷凍溶脂，可發現相關臨床應用文章逐步增加[7-9]。但脂肪冷損傷的基礎研究很少，其中一個重要原因是缺乏用于微創脂肪冷損傷的穩定的動物模型，這也進一步限制了脂肪冷損傷分子機制的研究。因此，建立良好穩定的皮下脂肪微創冷凍減脂模型是進行下一步機制研究的基礎。

本研究通過在溫度為-60 ℃，干預60 s條件下，成功建立了穩定的SD大鼠皮下快速脂肪冷損傷微創冷凍減脂動物模型。在溫度為-60 ℃，干預60 s條件下，可造成局部脂肪組織明顯損傷，炎癥反應明顯，細胞凋亡增加，但對局部皮膚組織、肌肉組織及臟器功能未產生明顯影響，這與脂肪細胞對冷損傷相對敏感有關，其動物死亡率低于20%，符合動物實驗模型需求。在建立脂肪冷損傷穩定動物模型的基礎上，發現局部炎癥反應與脂肪損傷之間有一定的關聯性。低溫干預大鼠腹股溝皮下脂肪后，脂肪冷損傷過程遵循炎癥-纖維化-愈合的創傷愈合規 律[10-13]。正常脂肪組織中相關炎癥因子NF-κB-p65及TGF-β1的表達量較低；不同低溫干預大鼠腹股溝皮下脂肪組織時，NF-κB-p65的表達量均有不同程度增加，在低溫干預第2周時表達最明顯，且與室溫對照組相比差異有統計學意義；而TGF-β1則干預4周后TGF-β1表達量明顯增加，與Control組相比差異有統計學意義；這與以往研究一致[3，14-15]。

本研究免疫組化結果表明低溫干預2周后，大鼠腹股溝皮下脂肪組織的炎癥因子NF-κB-p65表達明顯增高，大鼠脂肪組織炎癥反應明顯，在低溫干預4周后纖維化指標因子TGF-β1表達明顯升高，表明脂肪組織冷凍損傷修復具有纖維化直至傷口愈合的脂肪冷損傷規律特點，符合組織損傷愈合的標準，驗證了模型的可靠性。

綜上，在溫度為-60 ℃，干預60 s條件下，可建立穩定的SD大鼠皮下脂肪微創冷凍減脂動物模型。