鐵皮石斛中菲類化合物反應性與藥代動力學計算

翁約約，李震岳，余德觀，曾婧婕，吳守彪，劉瀟瀟，王朝杰

1.溫州醫(yī)科大學定理臨床學院 溫州市中心醫(yī)院 藥劑科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035；3.溫州市人民醫(yī)院 藥劑科，浙江 溫州 325000

蘭科植物為天然菲類化合物最豐富的來源，石斛屬中已分離得到24種[1]，僅鐵皮石斛（Dendrobium officinale）中就包含12種[2]：鼓槌菲（chrysotoxene,1）、毛蘭菲（confusarin, 2）、nudol（3）、2, 5-二羥基-3, 4-二甲氧基菲（4）、2, 3, 4, 7-四甲氧基菲（5）、2, 7-二羧基-1, 5, 6-三甲氧基菲（6）、2, 5-二羧基-3, 4-二甲氧基菲（7）、3, 5-二羧基-2, 4-二甲氧基菲（8）、denbinobin（9）、ephemeranthol A（10）、erianthridin（11）、2, 4, 7-三羥基-9, 10-二氫菲（12），見圖1。現(xiàn)代藥理學研究表明，該類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等藥理作用。化合物1、2、 3、9、10、12在體外實驗中表現(xiàn)出對肝癌[3-4]、肺癌[5]、骨肉瘤[6]等有抑制作用。化合物2和12被證實與維生素C的抗氧化活性相當[7]。化合物9和10抑制NF-κB信號傳導，發(fā)揮抗炎作用[8-9]。此外，化合物2還具有促進神經(jīng)突觸生長的作用[10]。迄今為 止，針對天然產(chǎn)物中菲類化合物的研究多集中于分離提取、藥理活性、作用機制及化學合成。

天然產(chǎn)物可成為藥物應用于臨床，除了需具備較高的藥理活性外，還應考慮藥物制劑的穩(wěn)定性與藥代動力學特點等。由于化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是反映藥物藥效、制劑穩(wěn)定性的直接因素，因此本研究運用密度泛函理論（density functional theory，DFT）計算方法，在ωB97XD/6-311+G（d,p）基組水平上對鐵皮石斛中12種菲類化合物幾何結(jié)構(gòu)和電子結(jié)構(gòu)、紫外-可見吸收光譜、反應性[分子表面靜電勢（molecular electrostatic surface potential,MESP）、全局和局部反應性描述符]進行計算研究，同時借助ACD/Labs percepta平臺預測該類化合物的理化性質(zhì)與藥代動力學特性，為鐵皮石斛中菲類化合物的相關(guān)實驗研究提供理論數(shù)據(jù)支撐。

1 計算方法

運用Gaussian 16量子化學程序包，采用DFT中ωB97XD方法，在6-311+G（d,p）基組水平上對鐵皮石斛中12種菲類化合物進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到穩(wěn)定構(gòu)型。在優(yōu)化結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，用同一基組水平的含時密度泛函理論（time-dependent density functional theory, TD-DFT）結(jié)合自洽反應場（selfconsistent reaction field, SCRF）方法中的極化連續(xù)介質(zhì)模型（polarized continuum model,PCM）[11]模擬環(huán)己烷、氯仿、甲醇環(huán)境，對其紅外光譜和紫外-可見吸收光譜進行計算。文獻表明ωB97XD方法在研究化合物光譜性質(zhì)時，其計算結(jié)果與實驗值吻合較好[12-13]。

利用概念密度泛函理論（conceptual density functional theory, CDFT）研究分子的親電/親核性，并解釋其反應活性和反應位點。首先用Multiwfn 3.8波函數(shù)分析程序[14]計算MESP，并通過可視化程序VMD[15]繪制分子靜電勢分布圖，預測藥物與受體的作用部位。全局反應性描述符可用于闡明分子中的化學鍵、反應機理和反應位點，比較化合物的反應活性。全局反應性描述符包括：電離勢（IP）、電子親和勢（EA）、電負性（χ）、整體硬度（η）、化學勢（μ）、整體親電指數(shù)（ω）和整體柔軟度（S），計算公式見文獻[16]。

在CDFT中引入福井函數(shù)，以衡量各個化合物當電子數(shù)或外部化學勢發(fā)生變化時的電子密度差異。簡縮福井函數(shù)（condensed Fukui function, CFF）：將福井函數(shù)收縮到原子上，使每個原子都有對應的數(shù)值，進一步地描述各原子的反應活性，f+表示親核進攻指數(shù)，f-表示親電進攻指數(shù)，f0表示游離基進攻反應指數(shù)。

12種菲類化合物使用基于QSAR模型的ACD/Labs percepta平臺對成藥性、藥代動力學性質(zhì)ADME/Tox及理化性質(zhì)進行分析。

2 結(jié)果

2.1 幾何結(jié)構(gòu) 菲是一類由三個苯環(huán)角型稠合而成的化合物。目前，已從鐵皮石斛中分離提取12種菲類化合物（見圖1）。將上述化合物在ωB97XD/6-311+G（d,p）水平，分別在3種溶劑環(huán)己烷、氯仿、甲醇中進行優(yōu)化，經(jīng)過紅外振動分析顯示無振動虛頻穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，代表性化合物的幾何結(jié)構(gòu)見圖2。同一化合物三種溶劑環(huán)境中的鍵長、鍵角、二面角結(jié)果相似，表明該類化合物具有良好的溶劑穩(wěn)定性。含羥基的菲類化合物，O-H鍵長平均為0.965 ?，與酚羥基O-H平均鍵長0.966 ?近似[17]；C-O（COH）鍵長1.345～1.363 ?小于環(huán)己醇中的C-O鍵長 1.434 ?[16]，考慮羥基上的O原子與菲環(huán)形成p-π共軛，導致C-O鍵長縮短。根據(jù)二面角可判斷化合物平面性，化合物4的二面角D（C5-C13-C12-C4）為22.15°，化合物7的二面角D（C5-C13-C12-C4）為21.90°，化合物8的二面角D（C5-C13-C12-C4）為23.11°。化合物1-8中，除4、7、8外，其余化合物二面角在±12°范圍以內(nèi)，可知4，5位引入取代基將影響菲環(huán)的平面性。

圖1 鐵皮石斛中12種菲類化合物結(jié)構(gòu)式

圖2 部分菲類化合物ωB9XD/6-311+G（d, p）水平環(huán)己烷、氯仿、甲醇環(huán)境中的主要鍵長[單位（?）]

2.2 紫外-可見吸收光譜 TD-DFT在計算分子量相對較小的基態(tài)結(jié)構(gòu)的垂直電子躍遷時能給出準確的吸收光譜[18]。因此，12種菲類化合物在ωB97XD/6-311+G（d,p）水平用TD-DFT計算甲醇中紫外-可見吸收光譜如圖3所示，進一步分析垂直激發(fā)能（E）、吸收波長（λ）、振子強度（f）和主要躍遷組態(tài)列于表1。圖3所示化合物1～8在180～220 nm（I）和230～300 nm（II）具有強吸收峰，化合物10～12為二氫菲， 吸收峰位于180～220 nm（I）和240～300 nm（II），I對應AB環(huán)，II對應ABC環(huán)，都具有雙峰曲線。化合物3的9，10位雙鍵被取代后轉(zhuǎn)化為化合物11，I出現(xiàn)明顯增色效應，II出現(xiàn)減色效應。12種化合物的紫外-可見吸收光譜均屬于π→π*躍遷，對于化合物1～5，紫外吸收II的最高峰以HOMO軌道電子向LUMO+1軌道躍遷為主，貢獻率在50%左右，化合物10～12的紫外吸收II最高峰主要來源于HOMO軌道電子向LUMO軌道躍遷，貢獻率達75%以上（見表1）。根據(jù)文獻[19]可知，實驗紫外-可見吸收光譜中：化合物4理論計算最大吸收峰為210 nm與246 nm， 實驗最大吸收峰為210 nm與259 nm；化合物5理論計算最大吸收峰為204 nm與248 mm，實驗最大吸收峰為212 nm與257 nm；化合物6理論計算最大吸收峰為205 nm與255 nm，實驗最大吸收峰為213 nm與 264 nm，化合物7理論計算最大吸收峰為211 nm與258 nm，實驗最大吸收峰為213 nm與259 nm，理論值與實驗值較吻合。同類化合物一般在紫外-可見吸收光譜上存在共性，可用于化合物類型的鑒定，根據(jù)上述實驗結(jié)果及理論結(jié)果推測，菲類化合物兩個譜帶分別位于200～230 nm與240～300 nm。若菲類化合物4位和5位同時引入取代基，如化合物4、7、 8，導致菲環(huán)平面結(jié)構(gòu)扭曲，紫外-可見吸收光譜λmax和εmax也受到相應影響。

表1 12種菲類化合物ωB97XD/6-311+G（d, p）水平甲醇環(huán)境中的紫外-可見吸收峰躍遷歸屬

圖3 12種菲類化合物ωB97XD/6-311+G（d, p）水平甲醇環(huán)境中的紫外-可見吸收光譜

2.3 MESP 許多重要的生化反應，包括藥物-受體及酶-底物的相互作用，首先應通過“識別”，這一過程主要以靜電相互作用為主導，而MESP非常適合分析這一識別過程[20]。MESP通過識別親核和親電攻擊的潛在位點來表征分子反應活性位點。12種菲類化合物中代表性化合物的MESP如圖4所示。藍色區(qū)域表示負電荷區(qū)域，易受到親電試劑的進攻；紅色區(qū)域表示正電荷區(qū)域，易受到親核試劑的進攻；白色表示零電位區(qū)域。其中，黃球?qū)o電勢極大值點，青球?qū)獦O小值點。由圖4可知，菲環(huán)母核通體顏色大都為藍色，菲環(huán)上C原子附近靜電勢為負，在其上方形成離域的大π鍵。靜電勢極小值大多出現(xiàn)在-OH（O）和C=O（O）附近，極大值出現(xiàn)在-OH（H）附近。菲類化合物的-OH（H）帶正電，而含氧自由基傾向于進攻正電荷多的原子，這可能與其抗氧化反應存在一定聯(lián)系。

圖4 部分菲類化合物靜電勢圖

2.4 反應性描述符

2.4.1 全局反應性描述符：12種化合物的全局反應性參數(shù)見表2，化學勢μ常用于描述平衡構(gòu)型的分子失去電子的能力，其絕對值越大，得到或失去電子的能力越強，即反應性越強。全局親電指數(shù)ω用于描述體系得到電子時的穩(wěn)定性，其值越大，親電性越強。η越小，表示微干擾下化學體系電子云抗畸變的能力越弱。

表2 ωB97XD/6-311+G（d, p）計算12種菲類化合物的全局反應性描述符

比較12種化合物的反應性發(fā)現(xiàn)，|化學勢|：菲醌型（化合物9）＞菲酸型（化合物6、7、8）＞菲型 （化合物1、2、4、3、5）＞二氫菲型（化合物10、11、12）；全局親電指數(shù)：菲醌型（化合物9）＞菲酸型（化合物6、7、8）＞菲型（化合物4、1、2、3、5）＞二氫菲型（化合物10、11、12）；整體硬度：二氫菲型（化合物12、10、11）＞菲型（化合物1、5、8、3、2、4、7、6）＞菲醌型（化合物9）。由于二氫菲型9，10位無雙鍵，整個體系電子密度降低，抗畸變能力最強，穩(wěn)定性增加。菲醌型1，4位C=O與相鄰苯環(huán)的大π鍵形成p-π共軛，電子云密度大，抗畸變能力最弱。推測12種化合物反應性：菲醌型＞菲型＞二氫菲型。

AMINAH等[21]對Confusarin和nudol進行了抗DPPH自由基清除的抗氧化活性測試，實驗顯示它們的IC50分別為（19.63±0.09）ppm和（37.91± 0.08）ppm，即化合物2的抗氧化性強于化合物3，與預測結(jié)果相符。

2.4.2 局部反應性描述符：采用CFF進一步分析各個化合物上的局部反應活性，極大值反應分子中相對其它原子更易發(fā)生親核/親電反應的位點。將菲與12種化合物的CFF（f+，f-，f0）、軟度（s+，s-）和局部親電指數(shù)（ω+，ω-）進行比較，菲C9、C10的f+與f-均最大，其次C3、C6，即C9、C10反應性最強，理論與實際相符。化合物1～7，C9與C10也最易發(fā)生親核或親電反應。其中化合物1～5為不含羧基的菲類，在C2或C7引入-OH、-OCH3，所連C、鄰位C及-OH（O）的f-較大，即易受親電試劑進攻。由于-OH（O）含孤對電子，-OH與-OCH3的對菲環(huán)給電子共軛效應大于吸電子誘導效應，致上述位點活化。化合物9含雙酮結(jié)構(gòu)，酮基上O18和O15反應活性強。化合物10～12屬于二氫菲，C2和C7連有-OH或-OCH3，C2和C7易受親核試劑進攻，-OH（O）易受親電試劑進攻，兩苯環(huán)連接處C12或C13也易發(fā)生親電反應，可生成聯(lián)芐類化合物。MESP與局部反應性描述符均預測-OH（O）易發(fā)生親電反應。

2.5 藥代動力學分析 據(jù)食品藥品監(jiān)督管理局統(tǒng)計，90%以上的候選藥物因安全性、藥代動力學因素、藥效性等方面問題導致無法上市[22]。明確中藥化學成分在人體內(nèi)的ADME/Tox過程是研究作用機制的前提，但傳統(tǒng)的動物實驗評估工作量大且過程緩慢，基于QSAR模型的ACD/percepta平臺對鐵皮石斛中12種菲類化合物進行成藥性與藥代動力學性質(zhì)評估。HAN等[23]使用ACD/Percepta平臺預測5種中草藥中13種雙芐基異喹啉生物堿的溶解度、LogP、Caco-2、P-gp、CYPs抑制情況等數(shù)據(jù)，與實驗數(shù)據(jù)相符。其他報道也證實對中藥成分的藥代動力學性質(zhì)預測，且結(jié)果可靠[24-25]。12種菲類化合物均符合Lipinski類藥五規(guī)則（rule-of-five, Ro5）[26-27]。

2.5.1 吸收：利用Caco-2細胞模型模擬人體內(nèi)腸道轉(zhuǎn)運，預測化合物的細胞滲透率。除化合物6、7、8在小腸內(nèi)吸收一般外，其余9種化合物小腸內(nèi)吸收均較好。口服藥物吸收后大多通過被動擴散進行轉(zhuǎn)運，LogP值0～3最佳，推測12種化合物被動擴散能力良好。

2.5.2 分布：血漿蛋白結(jié)合率表征化合物與血漿蛋白結(jié)合的能力，除化合物12血漿蛋白結(jié)合能力中等，其余11種化合物均較強。血腦屏障透過性指標顯示，化合物6、7、8不易透過血腦屏障，不易產(chǎn)生中樞性神經(jīng)系統(tǒng)方面的不良反應。

2.5.3 代謝：12種菲類化合物都不是糖蛋白底物（P-gp substrates）。化合物6、7、8對肝藥酶 （CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4）無抑制作用，化合物1～5對CYP1A2均有明顯抑制作用，其中化合物1對CYP3A4也有抑制作用。

2.5.4 毒性：抑制鉀離子通道可能會導致長QT綜合征，心律失常甚至猝死，使用hERG指標預測心臟毒性顯示，化合物6、7、8、9、12不抑制hERG，心臟毒性較弱。

3 討論

本研究應用DFT中ωB97XD方法在6-311+G（d,p）基組水平，計算了鐵皮石斛中分離提取的12種菲類化合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。菲類化合物紫外-可見吸收光譜兩個譜帶分別位于200～230 nm（I）與240～ 300 nm（II），屬于π→π*躍遷，菲類化合物9，10位雙鍵被取代后，I出現(xiàn)明顯增色效應，II出現(xiàn)減色效應。12種化合物反應活性依次是菲醌型＞菲型＞二氫菲型。比較各化合物的反應位點：化合物18，C9與C10反應活性最高；化合物9酮基上的O反應活性最高；化合物10～12苯環(huán)連接處的C鍵易斷裂，12種化合物中-OH（O）易發(fā)生親電反應。

經(jīng)ADME/Tox分析顯示12種菲類化合物均符合Lipinski類藥性原則，被動擴散能力佳，血漿蛋白結(jié)合能力強。化合物6～8對肝藥酶（CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4）作用較小，化合物1～5對CYP1A2抑制作用最強。同時，化合物6～8無心臟毒性，不易透過血腦屏障，且對肝藥酶的抑制作用較少，但腸內(nèi)吸收表現(xiàn)一般，若后期需應用于臨床，應經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾或劑型改造，提高其吸收利用度。

本研究基于DFT計算和ACD/Labs percepta平臺預測，建立了一條從“化學結(jié)構(gòu)-理化性質(zhì)-藥代動力學”的分析路線，通過研究活性單體及其結(jié)構(gòu)相似成分，有助于發(fā)現(xiàn)該類物質(zhì)共性，探討鐵皮石斛中菲類化合物成藥的可能性，便于篩選與結(jié)構(gòu)改造，為后續(xù)結(jié)構(gòu)改造和基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。