鐵過載對肝LO2細胞糖代謝關鍵酶活性的影響*

陶秀娟，劉賀榮，蔡慧珍，范彥娜，高清菡，楊建軍

(寧夏醫科大學公共衛生與管理學院，銀川 750004)

近幾十年來，2型糖尿病的患病人數在全世界都明顯上升[1]。據估計到2040年，全球成年糖尿病患者的比例將增加到10.4%，即6.42億糖尿病患者[2]。近年來，關于鐵過載與糖尿病關系的研究已逐漸成為糖尿病相關研究領域的熱點。體內鐵過載可能是引起2型糖尿病發病的獨立危險因素之一，機體鐵儲存量愈多，發生葡萄糖耐量異常、2型糖尿病或妊娠糖尿病的風險也愈大[3-5]。臨床研究或動物實驗均提示，機體鐵過載是糖尿病發病的危險因素，各種因素導致的鐵過載在糖尿病發生、發展過程中均扮演著重要的角色[6-8]。體內鐵含量的升高可導致葡萄糖代謝的紊亂，其機制可能與胰島素分泌受損或胰島素抵抗有關[9]。肝臟是鐵代謝的主要器官，也是鐵蓄積產生毒害的首要靶器官，鐵過載產生的活性氧通過肝臟激酶-B1/絲裂原活化蛋白激酶信號通路抑制胰島素受體在肝臟等組織中的磷酸化，降低胰島素受體的敏感度[10]。但肝臟鐵過載是否能引起肝細胞糖代謝關鍵酶活性的改變從而誘發肝臟糖代謝紊亂的相關報道尚少見。因此，本研究擬通過用不同濃度枸櫞酸鐵銨(ferric ammonium citrate,FAC)干預肝LO2細胞，探討鐵過載對LO2細胞活性氧水平及葡萄糖代謝關鍵酶活性的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑與儀器

RPMI 1640培養基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶購自上海逍鵬生物科技有限公司；FAC購自美國MedChemexpress生物科技公司；去鐵胺(desferrioxamine,DFO)購自美國Sigma-aldrich生物科技有限公司；細胞計數試劑盒(CCK-8)購自江蘇凱基生物技術有限公司；人葡萄糖激酶(glucokinase,GK)酶聯免疫分析試劑盒、人丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)酶聯免疫分析試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；活性氧(reactive oxygen species,ROS)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。Multiskan GO型酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；CO2培養箱(上海力申科學儀器有限公司)；F-4600型熒光分光光度計(日本日立公司)。

1.1.2細胞株

人肝LO2細胞株購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫，培養于含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養基，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，待細胞貼壁長至70%左右傳代，待細胞生長密度達到1×104個/mL時用于實驗。

1.2 方法

1.2.1LO2細胞分組與處理

取生長狀態良好LO2細胞胰酶消化后，取1×104/mL的細胞懸液，按檢測指標所需分別接種于無菌的96孔、12孔培養板內。以含10% FBS的RPMI 1640培養基培養24 h后，實驗分為5組，每組設5個復孔。(1)對照組：正常接種的LO2細胞+RPMI 1640培養基；(2)低劑量干預組：正常接種的LO2細胞+含7.5 mmol/L FAC的RPMI 1640培養基；(3)中劑量干預組：正常接種的LO2細胞+含75 μmol/L FAC的RPMI 1640培養基；(4)高劑量干預組：正常接種的LO2細胞+含750 μmol/L FAC的RPMI 1640培養基；(5)DFO處理組：正常接種的LO2細胞+含75 μmol/L FAC的RPMI 1640培養基干預18 h，加DFO(250 μmol/L)。

1.2.2檢測指標與方法

1.2.2.1LO2細胞活力檢測(CCK-8法)

取對數生長期LO2細胞，按照每孔5×103個細胞量接種于96孔板，待細胞貼壁后分5組干預。各組細胞每孔加入10 μL的CCK-8試劑，放入37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養箱內培養24 h，酶標儀測定在450 nm波長處測定吸光度(A)值。細胞活力(%)=[A(加藥)—A(空白)]/[A(0加藥)—A(空白)]×100。A(加藥):具有細胞、CCK8溶液和藥物溶液的孔的A值；A(空白):具有培養基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的A值；A(0加藥):具有細胞、CCK8溶液而沒有藥物溶液的孔的A值。

1.2.2.2ELISA檢測LO2細胞GK、PK活性

取對數生長期LO2細胞按每孔2×106個接種于12孔板，預先置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養箱內培養24 h，待細胞貼壁后分組干預。將干預好的細胞從培養箱中拿出，胰蛋白酶消化后離心5 min(1 000 r/min)磷酸鹽緩沖液沖洗2次，并稀釋細胞懸液使濃度達1×107/mL放入離心管。通過反復凍融，破壞細胞，2 000 r/min離心20 min，仔細收集上清液待檢。采用ELISA法，按照人GK、PK活性檢測試劑盒說明書進行操作。

1.2.2.3LO2細胞ROS水平檢測

取對數生長期LO2細胞按每孔2×106個接種于12孔板，預先置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養箱內培養24 h，待細胞貼壁后分組干預。按照ROS檢測試劑盒安裝熒光探針2，7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)后，收集細胞后用熒光分光光度計檢測，設置激發波長488 nm，發射波長525 nm，檢測各組細胞熒光強度。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 鐵過載對肝正常細胞LO2生物活性的影響

各組細胞活性比較，差異無統計學意義(F=2.710，P=0.070)，見圖1。

圖1 鐵過載對肝LO2細胞活力的影響(n=4)

2.2 鐵過載對正常肝LO2細胞葡萄糖代謝關鍵酶活性的影響

中、高劑量干預組細胞GK活性低于對照組，高劑量干預組PK活性低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；DFO處理組GK、PK活性高于中劑量干預組，但差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2、3。

a：P<0.05，與對照組比較。

a：P<0.05，與對照組比較。

2.3 鐵過載對正常肝LO2細胞活性氧水平的影響

高劑量干預組細胞內ROS水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

a：P<0.05，與對照組比較。

3 討 論

鐵是人體必需的微量元素，在機體吸收、利用、儲存及循環利用過程中維持著穩態水平。高鐵負荷和鐵代謝障礙疾病已經被證明和糖代謝異常發病風險的增高有關[11]。多個流行病研究顯示鐵過載與胰島素抵抗相關，其機制可能有多種[12-15]。

肝臟是鐵代謝的主要器官，也是鐵蓄積產生毒害的首要靶器官。肝鐵聚集與高鐵蛋白血癥、胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝有關[16-17]。在前期研究的基礎上，本研究以不同濃度FAC干預肝LO2細胞，在各組細胞FAC干預后細胞活性無差異的前提下，檢測各組細胞ROS水平，發現高劑量干預組細胞內ROS水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，說明LO2細胞鐵負荷達到一定水平后，打破了機體內ROS產生與機體ROS自我清除之間的相對平衡，可能對細胞造成過氧化損傷。

GK是一種己糖激酶,特異性存在于胰島β細胞和成熟肝細胞中。前者是催化胰島素分泌的限速步驟，后者參與糖原合成，因此，在糖代謝中發揮著重要作用。在GK基因中已經發現了大量致病突變。在臨床中，激活突變表現為先天性高胰島素血癥，而功能喪失突變會導致糖尿病[18]。通過GK傳感器的作用，人體不同細胞、器官形成了一個緊密調控和穩定的葡萄糖穩態網絡系統,始終維持人體血糖穩態[19]。本研究發現，GK在中、高劑量干預組活性下降，而在DFO處理組GK活性有所上升，可能的原因是DFO通過螯合鐵離子，降低了細胞ROS的產生，避免其對細胞產生氧化損傷，從而降低了鐵對GK活性的影響。

PK是糖酵解途徑的關鍵酶之一，催化磷酸烯醇式丙酮酸形成丙酮酸并生成ATP[20]。本研究發現PK在高劑量干預組活性下降。當肝細胞內GK與PK活性下降時，會導致糖原合成與葡萄糖利用減少，最終引起糖代謝紊亂，與胰島素抵抗的發生、發展密切相關[21]。

綜上所述，75、750 μmol/L FAC干預的細胞內GK、PK活性降低，可能是導致細胞糖代謝紊亂的原因之一，但其機制也有待進一步研究。