益腎化濕顆粒通過RhoA/ROCK1信號通路對糖尿病腎病炎癥的影響*

陳艷霞，涂衛平，房向東，柯 本，龍 脈，黃金菁

(南昌大學第二附屬醫院腎臟內科，南昌 330006)

傳統上認為糖尿病腎病是血流動力學和代謝因素相互作用的結果，但研究發現糖尿病腎病動物模型和糖尿病腎病患者中循環炎性因子的表達明顯上調，免疫細胞浸潤增加，黏附分子和趨化因子水平表達增加[1]，表明炎癥參與糖尿病腎病的發生及進展。目前關于糖尿病腎病的研究表明其發病機制是多因素的，其中免疫反應和炎癥起主要作用[2]。促炎信號通路及其下游產物正成為糖尿病腎病新的生物標志物和有前景的治療靶點。研究觀察發現，益腎化濕顆粒具有降低糖尿病腎病患者炎性因子的作用，但其具體機制不明確[3]。本課題組前期研究發現在高糖環境下培養的系膜細胞，其炎性因子如白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6等的表達明顯增加，其機制與RhoA/Rho相關卷曲螺旋形成的蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil containing protein kinase，ROCK1)信號通路有關，提示RhoA/ ROCK1信號通路參與糖尿病腎病的炎癥發病機制[4]。因此，本研究擬探討益腎化濕顆粒通過RhoA/ROCK1信號通路對糖尿病腎病炎癥的影響及可能機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級雄性SD大鼠60只，10～12周齡，體重(380±20)g；益腎化濕顆粒：成分包含人參、黃芪、白術、茯苓、澤瀉、半夏、羌活、獨活、防風、柴胡、黃連、白芍、陳皮、炙甘草、生姜、大棗，規格為10 g/袋，獲贈于廣州康臣藥業有限公司；ELISA試劑盒購自武漢優爾生商貿有限公司；Western blot檢測試劑購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1動物模型的制備與分組

60只SD清潔級雄性大鼠適應性喂養2周后分為對照組、糖尿病腎病組和干預組，每組20只。糖尿病腎病組與干預組大鼠采用腹腔注射佐鏈霉素(60 mg/kg)制備糖尿病腎病模型，注射佐鏈霉素72 h后檢測空腹血糖，若≥16.7 mmol/L為糖尿病模型建立成功。對照組予以普通飼料喂養，糖尿病腎病組與干預組予以高脂高糖喂養，糖尿病腎病造模成功的標準為連續2次空腹血糖≥16.7 mmol/L、24 h尿蛋白排泄率>30 mg，繼續喂養至8周后進行下一步的實驗。

1.2.2干預方法

采用灌胃給藥，干預組予以益腎化濕顆粒(5 g/kg)，按0.2 mL/10 g體重進行灌胃，每天1次；對照組及糖尿病腎病組給予等量0.9%生理鹽水進行灌胃；干預期間均采用普通飼料進行喂養，自由飲水，不使用任何降糖治療，干預時間為4周。

1.2.3標本留取

留取大鼠尾靜脈全血測血糖、血肌酐、核因子-κB(nuclear factor Kappa-B,NF-κB)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)；收集24 h尿液測24 h尿蛋白定量(全自動生化分析儀測定)；干預結束后各組SD大鼠處死，無菌留取腎臟，取部分腎組織于10%甲醛固定后進行光鏡的觀察，其余腎組織采用液氮保存用于Western blot檢測。

1.2.4ELISA檢測

全血離心，取血清進行NF-κB、IL-6、TNF-α表達水平的檢測，按NF-κB、IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒的說明進行操作，獲取吸光度(A)值，根據標準曲線計算NF-κB、IL-6、TNF-α表達水平。

1.2.5Western blot檢測

從液氮中取部分預留的腎組織，提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉入聚偏二氟乙烯(PDVF)膜，5%脫脂牛奶常溫下密封2 h。加抗體孵育過夜。取出后使用TBST液進行沖洗，使之結合二抗，60 min后清洗、顯色，對RhoA、ROCK1、NF-κB、IL-6、TNF-α相對表達水平進行檢測。

1.2.6蘇木素-伊紅(HE)染色

取SD大鼠腎組織，用4%甲醛浸泡，24 h后常規石蠟包埋并連續切片。脫蠟處理后放入不同濃度的乙醇中各復水3 min，蘇木素染色15 min，清洗3次后鹽酸乙醇分化處理30 s，1%伊紅染色，脫水處理后脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進行觀察并拍照。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 動物模型建立前3組大鼠一般情況比較

動物模型建立前，3組大鼠體重、血糖、血肌酐比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 動物模型建立前3組大鼠一般情況比較

2.2 藥物干預前3組大鼠一般情況比較

藥物干預前，與對照組比較，糖尿病腎病組24 h尿蛋白定量、血肌酐、NF-κB、IL-6、TNF-α水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；干預組與糖尿病腎病組以上指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 藥物干預前3組大鼠一般情況比較

2.3 藥物干預后3組大鼠一般情況比較

藥物干預后，與糖尿病腎病組比較，干預組24 h尿蛋白定量、血肌酐、NF-κB、IL-6、TNF-α水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 藥物干預后3組大鼠一般情況比較

2.4 藥物干預后3組大鼠腎臟病理變化情況

對照組腎組織的腎小球結構完整，皮、髓質分界清楚，系膜、基質未見明顯增生。糖尿病腎病組腎小球體積增大，部分系膜區增寬，系膜細胞數目有增加，可見部分毛細血管管腔變形擴張；腎小管擴張明顯，小管細胞肥大，管腔變窄，部分伴有小管上皮細胞空泡樣變性，提示糖尿病腎病中晚期的改變。干預組大鼠腎小球系膜增生較糖尿病腎病組略有減輕，見圖1。

A：對照組；B：糖尿病腎病組；C：干預組。

2.5 藥物干預后3組大鼠腎組織相關蛋白表達情況

與對照組比較，糖尿病腎病組腎組織RhoA、ROCK1、NF-κB、IL-6、TNF-α蛋白相對表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與糖尿病腎病組比較，干預組腎組織RhoA、ROCK1、NF-κB、IL-6、TNF-α蛋白相對表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

a:P<0.05。

3 討 論

炎癥已成為糖尿病腎病的重要病理生理機制，慢性微炎癥和免疫系統激活在糖尿病腎病發病機制中具有重要作用。腎組織中NF-κB的活化在糖尿病腎病的發生、發展中起重要作用，NF-κB易位進入細胞核并觸發靶基因的表達，導致持續并逐漸增強的炎癥表達不斷增加，最終導致腎臟纖維連接蛋白的過度表達和細胞外基質的沉積，加劇腎功能的惡化。

Rho蛋白屬于Ras蛋白超家族成員之一，是一組分子量為20×103～30×103的GTP結合蛋白，其作用與細胞骨架結構改變相關，與細胞形態、細胞黏附、信號傳導、細胞增殖等多種生物學行為也有密切聯系。被激活的Rho蛋白的靶效應器是Rho激酶，即ROCK，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是Rho下游靶效應分子中功能研究最為清楚的。ROCK由兩種同源性極高的異構體構成，ROCK1和ROCK2，腎組織中高表達ROCK1。阻斷糖尿病鼠的RhoA/ROCK通路后可以改善腎小球的通透性[5]和腎臟的血流動力學[6]。多項研究證實糖尿病腎病患者體內的RhoA/ROCK的激活增加，阻斷RhoA/ROCK信號通路后可以顯示出其腎保護作用[7]，均提示RhoA/ROCK信號通路參與糖尿病腎病進展的過程。

在本課題組前期的研究中發現，NF-κB的活化受RhoA/ROCK信號通路的調控[8]。QIAN等[9]在心肌缺血再灌注損傷的大鼠模型中發現，抑制RhoA/ROCK/NF-κB途徑，可以抑制炎性因子的表達，從而對心肌細胞起到保護作用。另有研究表明，抑制RhoA/NF-κB途徑，可以抑制晚期糖基化終末產物對糖尿病腎病患者足細胞的損傷，成為糖尿病腎病潛在的治療新靶點[10]。

益腎化濕顆粒由人參、黃芪、白術、茯苓、澤瀉、半夏、羌活、獨活、防風、柴胡、黃連、白芍、陳皮、炙甘草、生姜、大棗等藥組成，具有增強和調節免疫等藥理作用。主要成分黃芪能明顯提高其網狀內皮細胞的吞噬功能[11]。茯苓能激活腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)，減弱成纖維細胞激活和異常細胞外基質的沉積，降低尿蛋白[12]。劉孝琴等[13]研究發現益腎化濕顆粒可能通過降低早期糖尿病腎病患者高敏C反應蛋白和IL-8的表達，抑制炎性反應，從而對早期糖尿病腎病有一定的保護作用。沈文清等[14]以60例慢性腎臟病2～3期患者為研究對象，治療組口服益腎化濕顆粒，對照組口服中成藥腎衰寧片，觀察時間為6個月，治療組治療后高敏C反應蛋白、IL-6、TNF-α均較治療前下降，且差異有統計學意義(P<0.05)；對照組治療前后高敏C反應蛋白、IL-6、TNF-α水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示益腎化濕顆粒可改善慢性腎臟病2～3期患者的微炎癥狀態。

本研究結果發現益腎化濕顆粒干預患有糖尿病腎病的SD大鼠后，SD大鼠的24 h尿蛋白定量有一定程度下降，提示益腎化濕顆粒具有降低尿蛋白的作用，與益腎化濕顆粒治療糖尿病腎病有效性與安全性meta分析的結果一致[15]。且干預后的SD大鼠血清中NF-κB、IL-6、TNF-α的表達及腎組織中NF-κB、IL-6、TNF-α的表達均有下降，說明出益腎化濕顆粒具有下調炎性因子表達從而發揮腎保護作用。糖尿病腎病組SD大鼠腎組織RhoA、ROCK1、NF-κB蛋白的表達較對照組明顯升高，提示在糖尿病腎病的過程過中，RhoA/ROCK1/NF-κB信號通路被激活。予以益腎化濕顆粒干預后，干預組SD大鼠腎組織RhoA、ROCK1、NF-κB蛋白表達下調，推理出益腎化濕顆粒可能通過RhoA/ROCK1/NF-κB信號通路調控下游IL-6、TNF-α等炎性因子的表達，減輕糖尿病腎病的炎癥狀態，從而達到降低尿蛋白，改善腎功能的作用。目前本研究僅對益腎化濕顆粒的給藥劑量5 g/kg進行研究，藥物干預時間點為4周，不同的劑量及藥物干預時間點的作用有待于進一步的探究。

綜上所述，在糖尿病腎病的發生、發展過程中，RhoA/ROCK1/NF-κB信號通路被激活，成為糖尿病腎病防治的新靶點，益腎化濕顆粒能夠部分抑制RhoA/ROCK1/NF-κB信號通路，改善糖尿病腎病的炎癥狀態，具有延緩或逆轉糖尿病腎病進展的潛在價值。深入研究益腎化濕顆粒在糖尿病腎病中的機制，有望獲得更高的臨床應用價值。