oprC蛋白多克隆抗體制備及其免疫效果研究

陳 曦， 安 娜， 張 彬， 吳泳樺， 鄧 薔， 胡 冬

(四川省綿陽市中心醫院檢驗科， 四川 綿陽 621000)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii，A.baumannii)屬革蘭氏陰性菌，屬危害健康的主要病原菌之一，具有獲得性耐藥和環境適應能力，在醫院環境中廣泛存在，粘附性較強，可粘附在醫用器材和醫護人員手上、且存活時間較長[1]。目前國際上A.baumannii的疫苗尚未成功，導致A.baumannii感染在社區和醫院存在，且患者死亡率較高[2]。另外，A.baumannii基因組對大多數抗菌藥均產生耐藥性，且隨著臨床上使用抗生素的逐年增加，導致耐藥性逐年增強[3]，因此找到新的治療和預防策略從而對抗A.baumannii的感染已成為目前刻不容緩的工作。近幾年來，學者們對A.baumannii疫苗研究做出了較多探索，在研究中發現了滅活全細胞、外膜復合物和外膜囊泡等多組分抗原，外膜蛋白、膜轉運蛋白、生物膜相關蛋白、莢膜多糖和膜相關多糖等單抗原[4,5]。但這些抗原安全性卻有待研究。本文以A.baumannii外膜受體oprC為研究對象，探討其抗體制備過程和生物學活性，為A.baumannii疫苗的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑:健康BALB/c小鼠購自北京Vital River實驗動物技術有限公司，SPF級，生產許可證號：SCXK(京)2019-0103，使用許可證號：SCXK(京)2019-0006，體重(20±2)g。EcoRⅠ、HindⅢ酶購自Thermo Scientific；T4連接酶購自SinoBio；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷購自蘇州亞科科技有限公司；弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1抗原的制備:ATCC 17978培養基培養A.baumannii 16～18h，提取總DNA，以NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上oprC的DNA為目的基因，設計上游加EcoRⅠ(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')、下游加HindⅢ(5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')酶切位點的引物，擴增目的片段，反應程序為：95℃、5min，95℃、30s，55℃、30s，72℃、2min，35個循環；72℃、10min。T4連接酶連接目的片段到pET28a上，得重組質粒。重組質粒轉E.coli BL21感受態細胞中，制備單克隆菌落，并經雙酶切和測序驗證。單菌落37℃培養過夜，LB培養液在光密度值0.6時添加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導目的基因表達，SDS-PAGE鑒定重組蛋白表達情況，同時空載上所含(標簽)蛋白作為對照，載體標簽為N-His、N-Thrombin、N-T7、C-His。

1.2.2重組蛋白的純化:GST柱親和層析法純化蛋白。重組質粒菌液置于ATCC 17978培養液中培養并擴培，密度合適時離心收集細菌，每升菌液用50mL PBS重懸，加1%TritonC-100、1%β-巰基乙醇、苯甲基磺酰氟，并超聲裂解菌體，15000g離心10min取上清并添加GST-beads，輕搖1h吸附蛋白；2000g離心3min棄上清，加1mL GST Elution Buffer，輕搖10min，2000g離心3min收集上清，SDS-PAGE鑒定蛋白純度，Bradford法鑒定蛋白濃度，將蛋白置于-20℃保存。

1.2.3多克隆抗體的制備:純化好的融合蛋白作為抗原免疫小鼠，目的蛋白:弗氏完全佐劑=1∶1混勻后采用多線注射法皮下注射小鼠，一免為0.1mg蛋白/小鼠；一周后二免，目的蛋白:弗氏不完全佐劑=1∶1混勻后，0.1mg蛋白/小鼠皮下注射小鼠；三免、四免方法與二免相同且間隔時間相同。四免結束后4d眼部采血，采集的血液于37℃恒溫箱中靜置1h，4℃冰箱過夜，待血清析出后移置新的離心管中置于-20℃冰箱保存。陰性對照組同一時間點注射等體積PBS做對照處理，同時相同方法收集血清做陰性對照。

1.2.4抗體效價測定:酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測定抗體效價。抗原0.5μg，抗原包被液將抗原稀釋至100μL，加入96孔板中，4℃過夜；加入200μL PBST+5%脫脂奶粉，4℃封閉過夜，以1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200梯度稀釋陰性、陽性血清，每孔加100μL，37℃孵育1h；PBST洗板3次，加入1∶3000稀釋辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃孵育1h；加底物鄰苯二胺100μL，37℃孵育20min，2moL/L H2SO4終止反應，讀取OD 490，P/N≥2.1為判定標準，確定抗體最終效價。

1.2.5重組蛋白對感染小鼠的存活率:腹腔注射4.2×108CFU/mL A.baumannii，對60只小鼠進行攻毒實驗，小鼠表現為弓背、豎毛癥狀時，30只小鼠注射oprC蛋白多克隆抗體，另30只小鼠只進行攻毒實驗，從第0天開始至第21天觀察小鼠生存情況，統計21d生存率。

1.2.6感染后血清中荷菌量情況:另每組隨機6只小鼠感染12h，眼球靜脈取血50μL，無菌條件下涂板，平板置于37℃培養箱中培養過夜，計數細菌定值量。

1.2.7HE染色各組小鼠臟器情況:1.2.6小鼠取靜脈血后，分別取小鼠肺、肝臟、脾臟、腎臟，4%多聚甲醛固定，待固定后，經脫水處理，二甲苯透明，經包埋后，切片機切片，厚度4μm，蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察臟器病理變化和炎癥損失。

2 結 果

2.1目的片段擴增成功:NCBI中oprC全基因組為模板PCR擴增長度為2115bp，全基因組擴增大小為>2000bp，大體與oprC基因全長預期相符。見圖1。

圖1 PCR擴增oprC序列瓊脂糖膠圖片

2.2雙酶切鑒定重組質粒大小為1500bp-3000bp:目的片段與pET28a質粒連接，pET28a空質粒5369bp，篩選oprC+pET28a重組質粒，質粒圖譜見圖2。重組質粒經過EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切驗證連接情況。oprC+pET28a重組質粒經雙酶切后瓊脂糖膠上呈現兩個片段，1500bp-3000bp間為oprC片段，5000bp附近為pET28a質粒片段。空質粒pET28a片段長度5000bp附近。大小與預期相符。見圖3。

圖2 質粒圖譜

圖3 酶切鑒定重組質粒瓊脂糖膠圖片

2.3原核表達鑒定重組蛋白大小為70kDa:pET28a蛋白大小為26kDa，oprC蛋白大小為70kDa。異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導目的基因表達為蛋白，在97.2kDa附近蛋白表達量升高推測為oprC+pET28a重組蛋白(獨立組分)，20.1kDa與29.0kDa之間某一區域蛋白表達量升高，推測為pET28a標簽蛋白表達。大小與預期相符。見圖4。

圖4 重組蛋白鑒定SDS-PAGE膠圖片

2.4抗體效價為1∶12800，ELISA法檢測結果顯示，oprC抗血清效價為1∶12800。見圖5。

圖5 oprC抗血清效價檢測示意圖

2.5oprC蛋白多克隆抗體提高小鼠的存活率:攻毒實驗后注射oprC蛋白多克隆抗體小鼠存活率為80%，只進行攻毒實驗小鼠存活率為30%，兩者存活率比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 攻毒實驗后小鼠生存率情況

2.6oprC蛋白多克隆抗體降低感染后血液中荷菌量:感染12h后，單純攻毒實驗小鼠血液中荷菌量為(4.3×105/CFU)，攻毒實驗+oprC多克隆抗體小鼠血液中荷菌量為(1.9×105/CFU)；攻毒實驗+oprC多克隆抗體小鼠血液中荷菌量明顯低于單純攻毒實驗小鼠(P<0.05)。

2.7oprC蛋白多克隆抗體減輕組織病理損傷:攻毒實驗顯示小鼠肺組織中肺泡壁充血明顯、間質內血管明顯擴張，腔內出現明顯的炎癥滲出及炎癥細胞浸潤明顯；肝臟組織內變化不明顯；脾臟中紅髓變大、白髓變小，淋巴細胞數量減少、變得稀疏；腎臟組織中腎小球出現肥大、系膜增厚現象，腎小球基底膜增厚，組織纖維化、炎癥細胞浸潤明顯。攻毒實驗+oprC多克隆抗體中肝臟差異不明顯外，其余各組織癥狀均有所緩解。見圖7。

圖7 兩組肺、肝臟、脾臟、腎臟病理性損傷情況

3 討 論

A.baumannii是一種新型的機會型醫院病原菌，A.baumannii感染表現為醫院和社區獲得性肺炎、血流感染、心內膜炎、泌尿道感染、傷口感染、燒傷感染、皮膚和軟組織感染以及腦膜炎等[6]，危害嚴重。為降低A.baumannii感染的疾病，噬菌體和抗生素制劑治療A.baumannii，造成A.baumannii耐藥，嚴重影響治療效果[7]。改善A.baumannii耐藥性，可能是緩解疾病方法之一。A.baumannii外膜蛋白是目前研究最深入的耐藥蛋白之一，A.baumannii附著在支氣管上皮細胞中，參與氧化應激和抗微生物作用，從而發揮其功能[8]。外膜蛋白的研究中心在2014年6月研究中發現6個陽性蛋白，包括外膜蛋白ompA、omp34kDa，外膜受體蛋白oprC、oprB，OXA-23和鐵載體受體蛋白，這些外膜蛋白均存在于菌體表面，且與細菌毒力、耐藥性、細菌生長關系密切，可作為防治A.baumannii的抗原疫苗和被動免疫療法候選組分[8]。外膜蛋白ompA主要分布于菌體及其外膜囊泡中，可誘發宿主細胞氧化應激，并侵襲至線粒體和細胞核中，促進細胞凋亡壞死[9]；omp34kDa參與細胞粘附作用[10]。外膜蛋白的主動和被動免疫均可提高小鼠的存活率，抑制器官和外周血中的細菌負擔，并降低血清炎性細胞因子和趨化因子的水平[11]。外膜受體蛋白oprB影響葡糖糖轉運過程，DNJ-NAc可通過OprB進入細胞，DNJ-NA是一種與葡萄糖具有相似抗感染性蛋白[12]。OXA-23樣家族是伊朗A.baumannii和醫院不動桿菌對碳青霉烯耐藥的主要原因[13]。鐵載體受體蛋白在細菌鐵離子攝取機制中發揮重要作用，是細菌的毒力因子和潛在的疫苗靶基因[14]。外膜受體蛋白由于磷脂雙分子層對膜受體的動態構象、信號轉導及蛋白間的相互作用均有調節作用，可影響膜結構和功能。

本研究以外膜受體蛋白oprC為研究對象，其結構和功能尚未發現相關報道。根據NCBI中oprC的DNA全基因序列設計引物，在A.baumannii中克隆出全長，NCBI預測全長為2115bp，凝膠電泳預測正確。與pET28a構建重組質粒，并誘導重組蛋白大小表達，重組蛋白并作為免疫原免疫小鼠，得到抗血清抗體，抗體效價為1∶12800；且oprC蛋白多克隆抗體對A.baumannii感染小鼠有一定保護作用。小鼠全身感染A.baumannii模型在12h發現荷菌量在oprC蛋白多克隆抗體中出現明顯降低現象，且肺、脾臟、腎臟炎癥病理損傷得到明顯改善。早期4d過程中死亡率較高，且機體接種疫苗的免疫效果較差，抗A.baumannii的被動免疫可誘導小鼠產生較高的oprC抗體，介導體液免疫反應，從而治療疾病。

綜上所述，本研究成功構建并表達oprC重組蛋白，制備oprC蛋白多克隆抗體，并對oprC抗體的免疫保護效果做了初步探究，為A.baumannii基因工程重組疫苗奠定一定的基礎。