MCT2激活Nrf2通路調控H/R視網膜神經節細胞凋亡與焦亡

張小敏， 劉 文， 蔡傲竹

(武漢大學中南醫院眼科， 湖北 武漢 430070)

視網膜神經節細胞是影響視神經病變的重要細胞類型之一，例如青光眼、糖尿病視網膜病變以及視網膜缺血再灌注損傷等[1]。其中，視網膜缺血再灌注損傷是許多視網膜疾病發生的基礎，也是導致視力障礙或失明的主要原因，該過程可導致視網膜神經節細胞發生一系列損傷反應，從而破壞細胞正常生理功能，加重視網膜組織損傷。單羧酸轉運蛋白(monocarboxylate transporters，MCT)是溶質載體16轉運蛋白家族的成員，可介導細胞乳酸、丙酮酸及其它單羧酸的跨膜轉運[2]。研究表明，MCT2在整個視網膜內層大量表達，其表達受抑制將導致視網膜功能降低，同時降低光轉導敏感性和谷氨酸能神經元的水平[3]，這提示MCT2可能是治療視網膜疾病和保護視力的潛在靶點。鑒于此，本研究以缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)處理人視網膜神經節細胞RGC-5模擬視網膜缺血再灌注損傷模型，研究MCT2對RGC-5細胞的保護作用，并初步探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料：人視網膜神經節細胞RGC-5購于廣州博輝生物科技公司，Nrf2抑制劑ML385(純度99.59%，北京百奧萊博科技公司)，胎牛血清、青-鏈霉素雙抗溶液和DMEM培養基(美國HyClone公司)，Lipofectamine 2000脂質體試劑盒和Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)，M-MLV反轉錄試劑盒(上海生工生物工程公司)，AceQ qPCR Probe Master Mix(南京諾唯贊生物公司)，CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海弗元生物公司)，免疫熒光染色試劑盒(江蘇凱基生物公司)，Hoechst33342/PI雙染試劑盒、RIPA裂解液、Bradford蛋白測定試劑盒及ECL超敏發光液(上海碧云天生物研究所)，特異性抗體MCT2、Nrf2、Caspase-1、Bax、Caspase-3、Bcl-2、GSDMD、Caspase-1、NLRP3、IL-1β、GAPDH以及Alexa Fluor?647熒光二抗(英國Abcam公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物公司)。pcDNA3.1-MCT2重組質粒及陰性對照pcDNA3.1-NC重組質粒交由上海吉凱基因公司設計構建。

1.2方 法

1.2.1細胞培養與轉染：RGC-5細胞采用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養基，并置于37℃、5%CO2培養箱中常規培養。取對數生長期的RGC-5細胞，接種于6孔培養板，在培養箱內過夜培養，確保細胞貼壁后密度80～90%，采用脂質體Lipofectamine 2000試劑盒將pcDNA3.1-MCT2質粒轉染至RGC-5細胞中，記為MCT2組，NC組將pcDNA3.1-NC質粒轉染至RGC-5細胞中，并以正常培養未經轉染的RGC-5細胞作為對照組，轉染具體按照試劑盒說明書進行，4h后更換培養基。轉染48h后，通過實時熒光定量PCR和Western blot測定轉染效果，收集各組細胞進行后續實驗研究。

1.2.2實時熒光定量PCR：Trizol法提取細胞總RNA，微量核酸測定儀檢測總RNA純度與濃度，OD260/OD280值在1.8～2.0即為合格。取提取的總RNA，按照M-MLV試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，以獲得cDNA作為模板，通過實時熒光定量PCR實驗進行擴增以測定目的基因mRNA的表達水平，在CFX96熒光定量PCR儀上進行檢測，GAPDH作為內參基因。程序設置為：預變性，95℃ 5min；循環反應，95℃ 10s、60℃ 30s，循環35次，實驗重復3次。擴增結束后，采用χ2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。具體引物序列如下：MCT2，上游引物5’-CGTTGACAGCGAGGCGAATC-3’，下游引物5’-GTGGCATTTCTGCTCCTAGAGT-3’；GAPDH，上游引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，下游引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。

1.2.3Western blot法：在細胞中加入預冷RIPA緩沖液置于冰上裂解，提取總蛋白，Bradford法檢測蛋白濃度。制備10% SDS-PAGE凝膠，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，沸水浴煮沸10min，上樣至凝膠加樣孔內，經恒壓電泳分離蛋白，通過濕轉儀轉至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉2h，TBST洗膜，加入稀釋后的一抗工作液，4℃孵育過夜。次日，棄去一抗，TBST洗膜后，加入對應稀釋后的二抗工作液，室溫放置1h，TBST再次洗膜，利用ECL顯色，經過凝膠成像系統掃膜后拍攝圖像，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH的灰度值之比作為目的蛋白相對表達量。

1.2.4細胞H/R處理：取對數生長期的RGC-5細胞，0.25%胰酶消化，加入新鮮培養基制備細胞懸液，接種于24孔培養板，將其置于含有94%N2、5%CO2以及1%O2的培養箱，造成細胞缺氧，持續4h后，除去原培養液，更換新鮮培養液，并將細胞移至37℃、5%CO2以及21% O2的培養箱中繼續培養6h，使細胞復氧。

1.2.5實驗分組與處理：實驗分為4組進行，具體分組與處理如下：①對照組，RGC-5細胞正常培養，不進行任何處理；②H/R組，RGC-5細胞進行H/R處理；③MCT2組，轉染pcDNA3.1-MCT2質粒至RGC-5細胞，并進行H/R處理；④MCT2+ML385組，轉染pcDNA3.1-MCT2質粒至RGC-5細胞，進行H/R處理后使用Nrf2抑制劑2μmoL/L的ML385處理細胞24h。各組細胞進行相應處理后，收集細胞。

1.2.6CCK-8法：將處理后的各組RGC-5細胞接種于96孔板，放置于37℃、5%CO2的培養箱內培養，分別在24、48、72h檢測細胞的增殖活性，每分組設置6復孔，在各孔內加入CCK-8檢測液，混合均勻，放于培養箱反應2h后，酶聯免疫檢測儀測定450nm處各孔細胞的光密度值(OD值)。

1.2.7流式細胞術：將收集的各組RGC-5細胞以1500rpm離心5min，棄上清，PBS洗滌沉淀，加入適量Annexin V-FITC結合緩沖液重懸細胞，調整密度為5×105個/mL，取100μL懸液移入干凈離心管，依次添加5μL Annexin V-FITC和10μL PI，混勻，進行雙染操作，室溫避光孵育30min后，通過流式細胞儀測定各組細胞凋亡情況。

1.2.8Hoechst/PI染色法：將RGC-5細胞按分組處理完畢后，接種于含細胞爬片的24孔板中培養24h，更換為1mL含有染色液(5μL Hoechst 33342和5μL PI)的培養液進行處理，放置于37℃培養箱孵育30min，吸棄染色液，PBS清洗細胞，抗熒光淬滅劑封片，通過熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況，PI為紅色熒光，Hoechst為藍色熒光，隨機選擇6個視野，計數紅染細胞與藍染細胞，以兩者比值作為PI凋亡指數。

1.2.9免疫熒光染色：收集各組RGC-5細胞接種于含細胞爬片的24孔板中，加入預冷的丙酮固定細胞，采用0.25%Triton-X穿透液室溫作用10min，再用10%山羊血清在37℃下封閉2h，滴加特異性一抗Nrf2(1∶200)或Caspase-1(1∶200)，濕盒內4℃孵育過夜。次日，棄一抗，并用PBS清洗干凈，滴加熒光標記二抗(1∶500)，室溫繼續孵育1h，PBS清洗后，采用DAPI常溫避光孵育30min進行染核，PBS再次清洗后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察染色情況，并采集圖片，Image Pro Plus 6.0系統計算蛋白染色的熒光強度。

2 結 果

2.1各組細胞內MCT2 mRNA與蛋白表達水平比較：轉染后測定細胞內MCT2在mRNA與蛋白上的表達變化，與對照組比較，MCT2組細胞中MCT2 mRNA與蛋白的相對表達量均顯著上調(P<0.05)；此外，相較于NC組，MCT2組細胞中MCT2 mRNA與蛋白的相對表達量也均顯著上調(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組細胞MCT2 mRNA與蛋白表達水平測定結果

2.2各組細胞增殖活性比較：CCK-8檢測各組細胞增殖活性變化，檢測結果顯示，在24h、48h及72h，H/R組細胞增殖活性較對照組顯著下降(P<0.05)；MCT2組細胞增殖活性則顯著高于H/R組細胞增殖活性(P<0.05)；而相較于MCT2組，MCT2+ML385組細胞增殖活性顯著下降(P<0.05)，見圖2。

圖2 CCK-8檢測各組細胞增殖活性

2.3各組細胞凋亡與焦亡水平比較：流式細胞術檢測結果顯示，與對照組比較，H/R組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；MCT2組細胞凋亡率較H/R組則顯著減少(P<0.05)；此外，MCT2+ML385組細胞凋亡率較MCT2組顯著增加(P<0.05)，見圖3。

圖3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

由Hoechst/PI染色法檢測結果可見，各組細胞內均出現PI紅色熒光，說明細胞出現不同程度的凋亡，與對照組比較，H/R組細胞PI凋亡指數顯著升高(P<0.05)；與H/R組比較，MCT2組細胞PI凋亡指數顯著下降(P<0.05)；與MCT2組比較，MCT2+ML385組細胞PI凋亡指數則顯著升高(P<0.05)，見圖4。

圖4 Hoechst/PI染色觀察各組細胞凋亡情況(比例尺=100μm)

2.4各組細胞內凋亡與焦亡蛋白表達水平比較：Western blot檢測細胞內凋亡相關蛋白表達水平，與對照組比較，H/R組細胞中Bax和Caspase-3蛋白相對表達量均顯著上調，Bcl-2蛋白相對表達量顯著下調(P<0.05)；與H/R組比較，MCT2組中Bax和Caspase-3蛋白相對表達量均顯著下調，Bcl-2蛋白相對表達量顯著上調(P<0.05)；與MCT2組比較，MCT2+ML385組Bax和Caspase-3蛋白相對表達量均顯著上調，同時，Bcl-2蛋白相對表達量顯著下調(P<0.05)，見圖5。

圖5 Western blot檢測各組細胞凋亡相關蛋白表達

Western blot檢測細胞內焦亡相關蛋白表達水平，H/R組細胞內GSDMD、Caspase-1、NLRP3及IL-1β蛋白相對表達量較對照組均顯著上調(P<0.05)；與H/R組比較，MCT2組內GSDMD、Caspase-1、NLRP3及IL-1β蛋白相對表達量均顯著下調(P<0.05)；而相較于MCT2組，MCT2+ML385組GSDMD、Caspase-1、NLRP3及IL-1β蛋白相對表達量均顯著上調(P<0.05)，見圖6。

圖6 Western blot檢測各組細胞焦亡相關蛋白表達

2.5各組細胞內Nrf2與Caspase-1蛋白免疫熒光染色結果：免疫熒光染色觀察各組細胞內Nrf2與Caspase-1表達，染色結果顯示，與對照組比較，H/R組細胞內Nrf2熒光強度顯著減弱，Caspase-1熒光強度顯著增強(P<0.05)；與H/R組比較，MCT2組細胞內Nrf2熒光強度顯著增強，Caspase-1熒光強度顯著減弱(P<0.05)；而相較于MCT2組，MCT2+ML385組細胞內Nrf2熒光強度顯著減弱，Caspase-1熒光強度顯著增強(P<0.05)，見圖7。

圖7 免疫熒光染色檢測各組細胞Nrf2與Caspase-1表達(比例尺=50μm)

3 討 論

目前，視網膜缺血再灌注已被公認為各種視網膜疾病的關鍵病理因素，包括視網膜血管阻塞、急性青光眼、早產兒視網膜病變、年齡相關性黃斑變性和糖尿病性視網膜病變。急性青光眼作為最常見且最危險的眼部疾病，主要是由眼內壓的快速升高和降低引起的，可導致視網膜神經節細胞凋亡、軸突損傷和后續的視力喪失。盡管濾過手術和降壓藥等降低眼壓的策略在臨床實踐中得到廣泛應用，但一些開角型青光眼患者無法通過降低眼壓獲得有效治療，此外，降低眼壓的藥物如前列腺素類似物和縮瞳劑等，會產生各種局部或全身性副作用，從而限制了這類藥物的臨床應用[4]。因此，探索視網膜缺血再灌注損傷中相關的分子機制以開發安全有效的治療靶點，并對促進視網膜缺血再灌注介導的其他視網膜疾病的預防與治療均具有重大意義。

SLC16由MCT家族的14個成員組成，這些成員在細胞營養物質運輸以及細胞代謝和pH調節中均發揮著重要作用，與激素、脂質和葡萄糖穩態有關。近年來，MCT1～4被研究者們進行了大量且廣泛的研究，已揭示其參與了L-乳酸、丙酮酸、短鏈脂肪酸和單羧酸在各種組織中質子依賴型的轉運[5]。此外，MCT1、MCT 2和MCT 4在多種癌癥中過度表達，并與癌癥的預后惡化有關，抑制其表達可作為癌癥的一種新治療策略。MCT2在肝臟、腎、腦、心臟、脾臟等多種組織中表達，與一些疾病的發生發展有關，例如Harun-Or-Rashid等[6]通過將攜帶MCT2的AAV2腺相關病毒注射入青光眼模型中以提高MCT2表達后發現，MCT2促進了高眼壓期間單羧酸鹽在視網膜中的轉運，增加了視網膜神經節細胞數量，改善能量穩態并維持視網膜和視神經中的線粒體功能，這一結果提示MCT2可能在改善視網膜神經細胞損傷方面也發揮積極作用。

視網膜神經節細胞凋亡是包括青光眼在內的視網膜缺血再灌注損傷引發的疾病中的主要變化，此外，急性青光眼的眼壓升高與視網膜神經元細胞的凋亡呈正相關[7]。細胞焦亡即炎癥性程序性細胞死亡，對于防御病原微生物和機體危險信號至關重要。當遭受缺血性損傷時，受損組織會釋放危險信號，激活NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體，活化的NLRP3炎癥小體隨后裂解gasdermin D(GSDMD)蛋白，同時激活下游Caspase-1而催化炎癥因子IL-1β等的成熟和釋放，導致細胞焦亡發生。然而，過度的細胞焦亡會導致細胞不斷腫脹和裂解，從而致使細胞內容物大量釋放，從而引發強烈的促炎反應[8]。在機體內，細胞凋亡與焦亡的分子機制有所不同但又存在著一定聯系，腫瘤細胞焦亡機制在一定刺激下會被啟動，且在細胞焦亡現象中有檢測到Caspase-1通路的激活，而Caspase-1能夠進一步激活caspase-3/7誘導細胞凋亡[9]。而在H/R誘導的各種組織細胞損傷中抑制細胞凋亡途徑的激活及焦亡相關因子的表達，可降低炎癥與組織損傷，減緩疾病病程的發展[10]。本研究結果顯示，在H/R誘導的視網膜神經節細胞中過表達MCT2后，細胞增殖活性得到提高，細胞凋亡率減少，促凋亡相關蛋白Bax和Caspase-3表達下調而抗凋亡蛋白Bcl-2表達上調，同時，細胞焦亡相關蛋白GSDMD、Caspase-1、NLRP3及IL-1β表達均下調，由此說明，MCT2抑制了H/R處理下視網膜神經節細胞凋亡與焦亡。

本研究經檢測發現，H/R處理下視網膜神經節細胞中Nrf2熒光強度減弱而Caspase-1熒光強度升高，而在H/R誘導的視網膜神經節細胞中過表達MCT2后，細胞中Nrf2熒光強度增加，Caspase-1熒光強度減弱。Nrf2是全身抗氧化防御系統的關鍵核轉錄因子，在正常情況下，Nrf2與具有CNC同源性(ECH)相關蛋白1(Keap1)的Kelch樣紅細胞衍生蛋白結合作為復合物，并被限制在細胞質中進行泛素化和蛋白酶體降解；而在壓力條件下，Nrf2與Keap1分離并轉移到細胞核中，與DNA啟動子區域的抗氧化反應元件(ARE)結合，啟動ARE控制的抗氧化酶轉錄[11]。大量研究表明，激活Nrf2在眼神經退行性疾病中發揮保護視網膜神經節細胞的作用，例如，富馬酸單甲酯在缺血再灌注損傷后通過激活Nrf2信號通路發揮視網膜神經元保護作用，明顯改善了Nrf2調節的抗氧化基因的表達，降低了炎癥基因的表達，減少了神經節細胞層中神經元細胞損傷，并改善了小鼠視網膜缺血再灌注損傷后視網膜功能；MicroRNA-141作為Keap1的靶向抑制劑，可在紫外線誘導后的視網膜神經節細胞中引發Nrf2激活和細胞核易位，使ARE控制的抗氧化基因轉錄水平增強，從而減弱紫外線誘導的氧化應激和細胞死亡[12]。因此推測，在本研究中MCT2可能是通過激活Nrf2發揮了對H/R處理下視網膜神經節細胞的保護作用，為了進一步驗證該作用，通過以Nrf2抑制劑ML385抑制Nrf2激活后，MCT2對H/R處理下視網膜神經節細胞的保護作用消失或減弱。

綜上所述，H/R處理可誘導視網膜神經節細胞凋亡及焦亡，使細胞增殖活性下降，而MCT2能夠減輕H/R處理下細胞凋亡與焦亡，從而達到保護視網膜的作用，該作用可能是通過介導Nrf2激活實現的。本研究為視網膜缺血再灌注損傷以及其他視網膜相關疾病的治療研究提供了分子機制及理論依據，但關于MCT2在該體內試驗中是否同樣發揮作用需要進一步驗證。