不同益生菌配比發酵對蘋果汁主要香氣成分的影響

陳月星,譚思遠,李倩鈺

(1.商洛學院 生物醫藥與食品工程學院,陜西 商洛 726000;2.陜西省秦嶺特色生物資源產業技術研究院,陜西 商洛 726000)

益生菌生長于人體腸道及生殖系統內,有助于維持人體健康以及改善人體微生態平衡,是對人體有益的一類微生物,如動物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌等[1-2]。據報道,益生菌可以改善和促進人體腸道健康,增強人體的免疫力,緩解乳糖不耐受患者的癥狀,降低人體內的膽固醇,幫助人體產生所需的維生素,從而增強人體對營養的吸收和利用。有研究表明,在食品中加入益生菌對人體健康十分有益,能夠提高免疫力,維持腸道微生態平衡和降低患癌風險[3-6]。

近年來,隨著果蔬深加工技術的發展,益生菌在果蔬汁發酵中的研究報道屢見不鮮,益生菌發酵不僅可以改善果蔬制品的風味,增加果蔬制品的醫療保健作用,而且大大豐富了果蔬制品的種類。張桂芝等[7]利用乳酸菌發酵研制出新型火龍果復合發酵果蔬汁飲料;黃杰等[8]應用植物乳桿菌和發酵乳桿菌對香蕉胡蘿卜復合果蔬汁進行發酵,并確定其最佳發酵工藝條件;陳樹俊等[9]采用不同益生菌發酵復合果蔬汁,并對發酵前后抗氧化活性和工程成分進行對比分析,結果表明,與未發酵樣品相比,發酵果蔬汁多酚、黃酮質量濃度顯著升高(P＜0.05),各樣品對DPPH 自由基、·OH、ABTS陽離子自由基清除能力較消化前增強,且在模擬胃消化階段升高更明顯。然而,目前益生菌發酵果蔬汁的研究主要集中在理化指標的分析以及工藝條件優化上,如董曼等[10]采用SPME-GC-MS研究了自然發酵和接種發酵樹莓酒中的香氣物質,發現發酵后產生了具有醇香味的酯類物質。馬曉偉等[11]以紫心火龍果作為發酵原料,添加由產乳酸芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌組成的復配發酵劑0.1 g/100 m L,發酵后火龍果飲料色澤自然透亮且具有清雅和諧的果香。劉佳奇等[12]對乳酸菌發酵茶飲料配方進行了優化研究,確定植物乳酸菌發酵劑接種量質量濃度為1%,發酵溫度37 ℃,發酵時間36 h。孫達鋒等[13]對益生菌發酵銀杏汁進行優化,發現發酵后果汁香味濃郁,質地細膩,酸味適中。目前,在發酵果蔬汁中添加的益生菌菌種選擇比較單一[14-17],且多為單菌發酵和雙菌發酵,此外對于不同益生菌配比發酵果汁對于果汁本身香氣成分影響方面的研究較少,基于此,本試驗選用蘋果作為原料,研究動物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌及嗜酸乳桿菌的單一菌種和復合菌種分別發酵蘋果汁對蘋果汁特征香氣成分的影響。采用紫外-可見分光光度計測定發酵過程中蘋果汁光密度的變化,頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜聯用技術檢測發酵蘋果汁的香氣成分,分析不同果汁樣品中的特征香氣成分的含量差異,以期為益生菌發酵果蔬汁的研究與應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅富士(Malus pumilaMill.)蘋果,購于陜西商洛市華潤萬家超市,大小均一,無機械損傷,無病害或腐爛。

益生菌菌種有動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus),購于上海保藏生物技術中心。

MRS肉湯培養基,3-辛醇(標準品,純度＞98%),氯化鈉(分析純)。

1.2 儀器與設備

2000JP-1型榨汁機;YXQ-LS-70A 型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業有限公司),Allega X-30R 型高速冷凍離心機(貝克曼庫爾特商貿＜中國＞有限公司),SW-CJ-1F 型超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司),HWS-80型智能恒溫恒濕箱(上海索譜儀器有限公司),GCMS-TQ8040氣相色譜-質譜聯用儀(日本島津公司),UV-1700紫外-可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司),50/30 μm 聚 二 甲 基 硅 氧 烷/二 乙 基 苯(PDMS/DVB)萃取頭。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘋果汁的制備與發酵 挑選大小均一無

機械損傷,無病害或腐爛的蘋果,經清洗后去核切分放入榨汁機中處理,加入抗壞血酸、果膠酶充分進行護色、酶解,最后抽濾并調節p H 冷凍,待用。將保存于甘油管的3 株益生菌分別置于MRS液體培養基中,37 ℃靜置培養24 h,使菌種活化。向活化后的菌液中分別接種100 m L 蘋果汁,37 ℃條件下靜置培養18 h,當活菌數約達1×107CFU/m L后,將3種菌株分別按照單一菌種和多菌組合的方式(如表1所示),以體積分數2%接種量接種于500 m L 蘋果汁中,37 ℃發酵24 h,每隔2 h取樣測定OD 值,發酵結束后置于-20 ℃條件下保存,待用[18]。試驗處理及編號如表1所示。

表1 試驗處理Table 1 Treatment of experiment

1.3.2 蘋果汁OD 值測定 研究表明,發酵果蔬汁的光密度值與菌體數具有一定的相關關系[19],因此可在600 nm 的波長下測定出OD 值從而計算出發酵液中的活菌數。每個樣品重復5 次,取平均值。

1.3.3 香氣成分的提取 主要采用頂空式取樣,吸附法提取香氣成分,準確移取5 m L 樣品放入20 m L的進樣瓶中,再加入2 g氯化鈉與0.4 g/L 3-辛醇作為內標物。在45 ℃的環境中平衡進樣瓶30 min,之后將經過老化處理過的50/30μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯萃取頭插入其中,頂空吸附35 min后解吸[20-21]。

1.3.4 色譜條件與質譜條件 色譜條件[22-23]:30 m×0.25 mm,0.25μm DB-17MS毛細管色譜柱;進樣口溫度240 ℃;起始溫度為40 ℃,保持5 min后以4 ℃/min的速度升溫至120 ℃,再以6 ℃/min的速率升溫至230 ℃,保持10 min。

質譜條件[24]:電離方式為轟擊電離;電子能量70 e V;掃描質量范圍為35～500 amu;離子源溫度230 ℃。載氣為He;流速為1.92 m L/min;以不分流方式進樣。

1.3.5 數據統計分析 定性分析:將樣品檢測結果與質譜數據庫、保留時間和匹配度進行對比,有效的香氣成分為匹配度＞85的物質。

定量分析:檢測樣品時加入相同質量濃度的3-辛醇作為內標物,重復測定3次,并根據下式進行計算:

香氣物質含量=(各物質的峰面積/內標物的峰面積)×內標物質濃度

香氣值=(香氣物質含量/香氣閾值)×1 000

上面兩式中,香氣物質含量單位為mg/L,內標物質濃度單位為mg/L,香氣閾值單位為μg/L。

計算出各組發酵蘋果汁的香氣物質含量與香氣值后,應用SPSS16.0軟件采用t檢驗法分析各組結果之間差異的顯著性。

2 結果與分析

2.1 蘋果汁發酵過程中OD值的變化

蘋果汁發酵過程OD 值的變化如圖1所示,隨著發酵時間的延長,各組樣品OD 值呈對數趨勢上升,這與李維妮等[22]所研究的多種乳酸菌發酵蘋果汁時的微生物生長曲線相符合。在樣品發酵的過程中,前10 h各組樣品的光密度值并未發生明顯變化,總體趨于平穩;在樣品發酵12 h之后,各組樣品的光密度值開始快速增長,在發酵進行到18 h時,樣品光密度的增長開始變得緩慢。之所以出現上述變化趨勢是因為,根據微生物的生長規律,剛接種到樣品中的菌種,為適應新的環境調節自身代謝系統,細胞體積增大但數目不會增加;經過一定適應期之后,菌種適應了樣品中的環境開始以幾何級數增長,樣品光密度值快速增長;當樣品中菌體數目增長到一定程度后,營養物消耗以及菌種代謝所產生的酸、醇等物質積累,限制了菌體的繼續繁殖,使樣品光密度值變化趨于平穩。如圖1所示,在發酵終點時,單菌發酵組的光密度值普遍低于多菌發酵組的光密度值,第4組樣品的光密度值最高,其次是第9組、第8組和第6組依次遞減,第1組樣品的光密度值最低,表明多菌種配比發酵可在一定程度上使蘋果汁中活菌數增加。

圖1 不同蘋果汁發酵組OD值的變化Fig.1 Change of OD value during fermentation

2.2 蘋果汁的香氣物質含量分析

共檢測出香氣成分31 種,其中醇類物質9種,酯類物質16種,其他香氣成分6種。加入不同益生菌配比的蘋果汁發酵2 d后,經過檢測發現樣品中都含有醇類香氣物質,但是種類和含量存在顯著差異。10組樣品中共檢測出9種醇類香氣成分,占總香氣成分的46.3%～37.7%,分別是乙醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、正戊醇、正己醇、6-甲基-5-庚烯-2-醇、正辛醇、芳樟醇和香茅醇。其中,正己醇、6-甲基-5-庚烯-2-醇、正辛醇、芳樟醇和香茅醇均屬于高級醇,可以使果汁產生清新淡雅的香氣,同時也作為其他香氣物質的良好溶劑以保持蘋果汁香氣的整體性。

如表2所示,在所測的10組樣品中6-甲基-5-庚烯-2-醇的含量最高,約為1.463～1.325 mg/L;其次是2-甲基-1-丁醇,含量為1.087～0.989 mg/L;乙醇含量為0.972～0.873 mg/L;正丁醇含量為0.437～0.389 mg/L;正己醇含量為0.272～0.216 mg/L。總體而言,除第8組樣品外,單一菌種發酵的樣品中醇類香氣物質的含量普遍低于多菌種混合發酵的樣品,說明多菌種混合發酵在一定程度上有助于醇類香氣物質的生成。該結論與林曉姿等[3]所研究的乳酸發酵葡萄全汁中植物乳桿菌、副干酪乳桿菌副干酪亞種的單菌株及其復配菌樣品風味分析的結果一致。

表2 不同蘋果汁發酵組的香氣物質含量Table 2 Contents of aroma substances in fermentation group of apple juice

酯類香氣物質是蘋果汁所有香氣物質中含量最多且種類最為豐富的香氣成分。有研究表明,富士蘋果中的酯類香氣物質多達50余種,且含量最高,對整體香氣的表達起至關重要的作用[25]。本次試驗共檢測出16種酯類香氣物質,占總香氣物質的61.3%～58.5%。由表4可知,含量較高的前3 個成分分別是2-甲基丁酸乙酯,含量為1.708～1.539 mg/L;丁酸乙酯,含量為1.716～1.524 mg/L;2-甲基丁基乙酸酯,含量為1.403～1.233 mg/L;含量最低的是丙酸丁酯,平均含量僅有0.012 mg/L左右。由單一菌種發酵的樣品中酯類香氣物質的平均含量普遍低于多菌種發酵的樣品。

在所有樣品中除檢測出大量的醇類、酯類香氣物質外,還檢測出一些其他類型的具有揮發性的香氣成分,如酚類、醛類和酮類。這些物質雖然含量較低,但對發酵蘋果汁的整體香氣同樣具有一定的貢獻。本試驗在10組樣品中共檢測出6種其他類型的香氣物質,分別是乙醛、反-2-己烯醛、甲基庚烯酮、香葉基丙酮、乙偶姻、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。這些物質的含量基本為0.254～0.377 mg/L,占總香氣含量的2%～3.3%,且單菌種發酵的樣品含量均低于多菌混合發酵的樣品。

2.3 蘋果汁香氣物質的香氣值分析

根據現有資料查詢上述香氣成分的香氣閾值,并通過樣品中香氣物質的含量與該物質香氣閾值之比,確定該成分的香氣值。香氣值越大對香氣的貢獻越大,香氣值大于1被認為是在蘋果汁香氣中起主要作用的成分,即蘋果汁的特征香氣成分。在檢測出的31種香氣成分中,可作為發酵蘋果汁特征香氣的共有17種,其中醇類香氣物質3種、酯類香氣物質11種、其他香氣成分3種。

2.3.1 蘋果汁中醇類香氣物質的香氣值分析雖然醇類香氣物質在總香氣物質中所占的比重較大,但9種醇類香氣物質的香氣值均不高,因此能夠作為典型香氣的成分并不多。在第1組、第2組、第3組、第8組、第9組和第10組的樣品中僅有2-甲基-1-丁醇和芳樟醇兩種物質的香氣值大于1,可以作為特征香氣;第4組、第5組、第6組和第7組的樣品中則有2-甲基-1-丁醇、芳樟醇和香茅醇3種物質可作為特征香氣。上述香氣物質的香氣閾值很高,且其香氣值較低因此對樣品香氣的整體貢獻并不大。

各組樣品2-甲基-1-丁醇香氣值分析如圖2所示,2-甲基-1-丁醇香氣閾值為500μg/L,在各組樣品醇類香氣物質中的含量為1.087～0.989 mg/L,能夠賦予蘋果汁清香,是蘋果汁的常見特征香氣之一。由圖2可知,各組樣品中2-甲基-1-丁醇香氣值約為2.174～1.978,其中第4組香氣值最高,其次為第5組,二者與其他組之間差異顯著(P＜0.05),第1組香氣值最低。

圖2 2-甲基-1-丁醇的香氣值分析Fig.2 Aroma value analysis of 2-methyl-1-butanol

各組樣品芳樟醇香氣值分析如圖3所示,芳樟醇又名沉香醇,屬于鏈狀萜烯醇類,具有鈴蘭香氣,在許多植物中均存在此類物質,香氣閾值為6 μg/L,香氣值為6.333～5.167,是對整體香氣貢獻最大的醇類物質。由圖3可見,在10組樣品中芳樟醇香氣值以第5組最高,且與其他組差異顯著(P＜0.05),其次為第6組和第2組。

圖3 芳樟醇的香氣值分析Fig.3 Aroma value analysis of linalool

各組樣品香茅醇香氣值分析如圖4所示,香茅醇為一種萜類物質,具有類似新鮮玫瑰的特殊香氣。10 組樣品中含量約為0.054～0.032 mg/L,香氣閾值為40μg/L。由圖4 可見,第4組、第5組、第6組和第7組的香氣值大于1,因此可作為上述4組樣品的特征香氣,其中第6組的香氣值顯著高于其他組(P＜0.05)。

圖4 香茅醇的香氣值分析Fig.4 Aroma value analysis of geraniol

2.3.2 蘋果汁中酯類香氣物質的香氣值分析10組樣品中檢測到的16種酯類香氣物質中有11種物質的香氣閾值大于1μg/L,分別是丙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、丁酸丙酯、戊酸乙酯、乙酸己酯和2-甲基丁酸丁酯。其中,丙酸乙酯、戊酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯以及2-甲基丁酸乙酯雖然含量極低但香氣值較為理想,所以對整體香氣具有一定的貢獻。在所有酯類特征香氣中丁酸乙酯、乙酸丁酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯和乙酸己酯的香氣值非常高,對整體香氣貢獻很大,賦予了蘋果汁強烈的果香。

各組樣品2-甲基丁酸乙酯香氣值分析如圖5所示,2-甲基丁酸乙酯香氣閾值為0.2μg/L,廣泛存在于蘋果、草莓等水果中,具有香甜青蘋果味。在所測定的10組樣品中平均含量為1.596 mg/L,香氣值普遍較高,是對整體香氣貢獻最為突出的物質。由圖5可知,在10組樣品中第4組與第6組的香氣值最高,且與其他組之間差異達到顯著水平(P＜0.05),以第7組香氣值最低。

圖5 2-甲基丁酸乙酯的香氣值分析Fig.5 Aroma value analysis of ethyl 2-methyl butyrate

各組樣品丁酸乙酯香氣值分析如圖6所示,丁酸乙酯香氣閾值為1μg/L,存在于香蕉、菠蘿等水果中,具有蘋果氧化味、甜香味。在所測10組樣品中,第4組和第6組樣品的香氣值最高,且與其他組之間差異達到顯著水平(P＜0.05),以第8組香氣值最低。

圖6 丁酸乙酯的香氣值分析Fig.6 Aroma value analysis of ethyl butyrate

各組樣品乙酸乙酯香氣值分析如圖7所示,乙酸乙酯在蘋果、香蕉、芒果、紅茶、白酒、紅酒中有發現,香氣閾值為2μg/L,具有果味、溶劑味。在所測10組樣品中,第6組樣品的香氣值最高,其次為第5 組、第4 組,三者均顯著高于其他組(P＜0.05),以第9組樣品香氣值最低。

圖7 乙酸乙酯的香氣值分析Fig.7 Aroma value analysis of ethyl acetate

各組樣品2-甲基丁基乙酸酯香氣值分析如圖8 所示,2-甲基丁基乙酸酯香氣閾值為11 μg/L。在所測10組樣品中,第4組和第6 組樣品中的香氣值最高,其次為第5組和第7組,顯著高于剩余組樣品香氣值(P＜0.05),第1組的香氣值最低。

圖8 2-甲基丁基乙酸酯的香氣值分析Fig.8 Aroma value analysis of 2-methyl-butyl acetatee

各組樣品乙酸丁酯香氣值分析如圖9所示,品乙酸丁酯香氣閾值為66,具有令人愉悅的果香。在所測10組樣品中,第5組樣品的香氣值最高,顯著高于其他組(P＜0.05),其余各組之間差異不顯著,其中第1組香氣值最低。

圖9 乙酸丁酯的香氣值分析Fig.9 Aroma value analysis of butyl acetate

除這些香氣物質以外,還有2-甲基丁酸丁酯、丁酸丙酯、2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丙酸乙酯、丙酸乙酯、戊酸乙酯也屬于蘋果汁的特殊香氣物質。其中,2-甲基丁酸丁酯具有青蘋果味,丁酸丙酯具有類似菠蘿、香蕉的香韻,兩者單菌發酵的香氣值均低于混菌發酵。丙酸乙酯具有類似菠蘿的香氣,戊酸乙酯具有鮮蘋果的香氣,單菌發酵組的香氣值普遍較低。此外,有研究表明若樣品中乙酸乙酯的含量過高,會使樣品產生不愉快的溶劑氣味[26]。

2.3.3 蘋果汁其他類香氣物質的香氣值分析在所檢測的6種其他香氣成分中,香氣值大于1的共有3種,分別是乙醛、反-2-己烯醛、甲基庚烯酮。其中乙醛和反-2-己烯醛在所有樣品中的香氣值均大于1,因此可以作為發酵蘋果汁的特征香氣成分。

各組樣品乙醛香氣值分析如圖10所示,乙醛香氣閾值為20,由于樣品中的菌種進行糖代謝而產生的中間產物,在各組樣品中的含量均不高,但香氣值較為理想,是蘋果汁的特征香氣成分,其中第9組、第4組、第2組的香氣值尤為突出,顯著高于其他組(P＜0.05),以第8組香氣值最低。

圖10 乙醛的香氣值分析Fig.10 Aroma value analysis of acetaldehyde

各組樣品反-2-己烯醛香氣值分析如圖11所示,反-2-己烯醛香氣閾值為17μg/L,具有令人愉悅的果香及綠葉香氣。在第3組樣品中并未檢測出此類物質的存在,但在除第3組以外的樣品中均有檢出且香氣值大于1。第4組與第9組樣品的香氣值含量尤為突出,與其他組之間差異顯著(P＜0.05)。

圖11 反-2-己烯醛的香氣值分析Fig.11 Aroma value analysis of trans-2-hexenal

各組樣品甲基庚烯酮香氣值分析如圖12所示,甲基庚烯酮香氣閾值為50μg/L,具有類似柑橘的香氣,是合成芳樟醇的中間體。在所測的10組樣品中第1組與第5組樣品的香氣值最高,但第4組與第7組的香氣值則不理想。

圖12 甲基庚烯酮的香氣值分析Fig.12 Aroma value analysis of methyl heptenone

除上述3種特征香氣外,還在第3組樣品中檢測出了少量香葉基丙酮,該物質香氣閾值為60,具有甜味和青草味;在第3組、第4組、第8組和第9組樣品中檢測出了乙偶姻,該物質是由于樣品內菌種發酵蘋果酸過程中檸檬酸分解為丙酮酸時產生的中間代謝產物,具有奶香味,在樣品中含量極少,對整體香氣貢獻小。

2.4 香氣成分含量及香氣值t檢驗分析

將所有樣品中香氣物質的含量及其香氣值分為單一菌種和混合菌種兩組進行t檢驗,結果表明,單一菌種發酵的樣品與混合菌種發酵的樣品的香氣物質含量(P=0.031)及其香氣值(P=0.048)的差異均達到顯著水平,說明混合菌種發酵的樣品中香氣成分的含量明顯高于單一菌種發酵的樣品,可賦予蘋果汁更加濃郁的香氣。

3 討論與結論

蘋果汁因其口感優良且富含糖類、有機酸、多酚、維生素等多種營養成分,而廣受人們喜愛,其香氣成分是影響其獨特風味與品質的重要因素[25]。經過益生菌發酵后的果汁既不失水果的自然風味,又具有發酵的獨特風味[27-29]。蘋果汁中的香氣成分復雜,且多數含量較低,目前采用的富集和分析方法主要是頂空固相微萃取法與氣相色譜-質譜等設備聯用,檢測揮發性香氣成分具有快捷、經濟、安全、選擇性好且靈敏度高等優點[22]。

本研究共檢測出31種香氣成分,可作為發酵蘋果汁的特征香氣的共有17種,其中,反-2-己烯醛和香茅醇由于個別樣品的香氣值小于1只能作為個別樣品的特征香氣。在所有香氣成分中,醇類香氣物質在總香氣物質中所占的比重相對較大,占總香氣成分的46.3%～37.7%,但9種醇類香氣物質的香氣值均不高,因此能夠作為典型香氣的成分并不多。酯類香氣占總香氣物質的61.3%～58.5%,對整體香氣的貢獻最為明顯,特別是2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸己酯、2-甲基丙酸乙酯和2-甲基丁基乙酸酯無論含量或香氣值方面都對整體香氣貢獻尤為突出。在所有樣品中除檢測出大量的醇類、酯類香氣物質外,還檢測出一些其他類型的具有揮發性的香氣成分,占總香氣含量的2%～3.3%,如酚類、醛類和酮類。這些物質雖然含量較低,但對發酵蘋果汁的整體香氣同樣具有一定的貢獻。

香氣成分是影響果品鮮食、加工質量及典型性的重要因素,因此分析和研究蘋果汁的香氣成分,對改善果汁的口感、品質具有重要意義。總體來看,在所測定的10組樣品中,第4組樣品在特征香氣香氣值以及香氣種類、含量等方面優于其他各組樣品。由單一菌種發酵所得樣品在特征香氣的種類、含量和香氣值等方面均沒有混合菌種發酵的樣品優秀,且兩者的差異顯著性小于0.05。這進一步說明了混合菌種發酵在一定程度上賦予樣品更濃郁的香氣。這對今后發酵果蔬汁香氣成分的研究提供一定的助力。