青枯菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)HrcN 原核表達與亞細胞定位

周大祥,楊俊年,龍泉洲,殷幼平,熊 書

(1.重慶大學 生命科學學院,重慶市基因功能與調(diào)控重點實驗室,重慶 400300;2.重慶三峽學院 生物與食品工程學院,重慶 404120;3.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學校 基礎(chǔ)醫(yī)學部,重慶 404120)

青枯病由青枯菌(Ralstonia solanacearum)引起,是一種世界性分布的重大病害[1]。該菌能夠侵染50多個科200余種植物,在全球范圍內(nèi)曾導致重大的經(jīng)濟損失。青枯菌能夠在潮濕的土壤或水體中存活數(shù)年[2],當遭遇易感寄主,青枯菌就會進入植物根部,在根部皮層定殖,然后入侵木質(zhì)部導管,最終通過導管系統(tǒng)迅速擴展到植物地上部,在寄主體內(nèi)大量增殖引起導管堵塞、功能紊亂,出現(xiàn)萎蔫癥狀。

自青枯菌基因組測序完成后,在致病力分化[3]、群體感應[4]、分泌系統(tǒng)[5-6]和寄主免疫應答[7-8]等方面研究進展較快,相應的基因功能與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相繼被解析[9-10]。青枯菌利用Ⅲ型分泌系統(tǒng)(typeⅢsecretion system,T3SS)將效應蛋白分泌注入植物細胞中,而效應蛋白的分泌由T3SS轉(zhuǎn)位介導。T3SS 含有多種ATP 酶,為效應蛋白的分泌提供能量[11]。hrc N基因作為T3SS結(jié)構(gòu)基因之一,表達產(chǎn)物為ATP 酶(ATPase),通過催化ATP 水解為效應蛋白的分泌提供能量。Hrc N 蛋白可利用水解ATP 產(chǎn)生的能量重塑多種蛋白底物,因此,其在膜融合、蛋白質(zhì)修飾和降解等許多生理活動中發(fā)揮重要的作用[12]。

野油菜黃單胞菌辣椒瘡痂致病變種(Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)敲除hrc N基因后,導致一些需要能量才能轉(zhuǎn)運的效應蛋白分泌受阻,病原菌致病力降低,表明hrc N基因?qū)Σ≡闹虏⌒杂兄匾挠绊慬13]。丁香假單胞菌菜豆致病變種(Pseudomonas syringaepv.phaseolicola)的Hrc N 是一種通過寡聚作用激活的ATP酶,電鏡觀察、流體力學和蛋白表達等分析發(fā)現(xiàn),Hrc N 有4種不同的組成形式,其中十二聚體是細胞內(nèi)膜的主要形式,其ATP 酶活性比單聚體的高700倍。Hrc N 作為激活的同源寡聚物催化蛋白質(zhì)易位,對T3SS和細菌的致病性有重要的影響[14]。Hrc N 的穩(wěn)定性依賴于保守的Hrc L蛋白,該蛋白與HrcN 結(jié)合,Hrc N 和Hrc L均與保守的內(nèi)膜蛋白Hrc U 相互作用[13]。由于T3SS分子伴侶不能被分泌或轉(zhuǎn)運,必須在效應蛋白分泌前從分子伴侶-效應蛋白復合體中釋放出來,這種作用是由T3SS相關(guān)的ATP 酶(InvC和Hrc N)以ATP依賴的方式進行的。這些ATP酶也作為T3SS效應蛋白的去折疊酶發(fā)揮作用,使效應蛋白保持未折疊或部分未折疊的構(gòu)象[15]。最近Gan等[16]研究發(fā)現(xiàn)Hrc N 以ATP依賴的方式催化分子伴侶HpaB與T3SS效應蛋白復合物釋放出游離效應蛋白。

青枯菌Hrc N 蛋白Motif預測顯示該蛋白為ATP酶,定位于細胞內(nèi)膜和細胞質(zhì)。根據(jù)現(xiàn)有的文獻報道和預測結(jié)果,推測HrcN 蛋白是一種位于青枯菌細胞內(nèi)膜上的ATP 酶。為了驗證此假設(shè),本研究對青枯菌hrc N基因進行原核表達和蛋白亞細胞定位,初步分析該蛋白的功能,為進一步深入分析青枯菌T3SS及其效應蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型番茄青枯菌CBM613 菌株由西南大學植物保護學院馬冠華教授饋贈。DH5α和農(nóng)桿菌GV3101,pET30a和p RI-eGFP質(zhì)粒載體由重慶大學生命科學學院重慶市基因功能與調(diào)控重點實驗室保存。孔雀綠磷酸酶檢測試劑盒購自美國Hayward公司。限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ和NdeⅠ等購自美國Thermo 公司;IPTG、MES和乙酰丁香酮等購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司。Ni-NTA sefinose Column及其支撐介質(zhì)購自生工生物工程(上海)股份有限公司,其余試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.2 青枯菌HrcN 蛋白原核表達分析

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)CBM613 菌株hrc N基因序列及p ET30a多克隆位點設(shè)計引物(5′→3′),L2024:GGCTGATATCGGATCCAT GACCCATCTCGCGCTG,下劃線為BamHⅠ酶切位點;L2025:GGTGGTGGTGCTCGATCATGCCAGTGCGATCTCGTC,下劃線為XhoⅠ酶切位點。下劃線前面是p ET30a載體序列,后面是hrc N基因序列。以青枯菌CBM613菌株基因組DNA 為模板進行PCR 擴增,將回收的DNA片段連接到T 載體,轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌,挑取PCR 驗證過的陽性克隆菌株測序。同時將電泳后回收的PCR 產(chǎn)物與BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的p ET30a質(zhì)粒無縫克隆構(gòu)建重組載體p ET30ahrc N。以L2024/L2025 為p ET30a-hrc N載體進行引物鑒定,并送蘇州金維智生物科技有限公司測序。

1.2.2 重組蛋白誘導表達及純化 挑取陽性克隆(p ET30a-hrc N)接種于含卡那霉素(Kan)的LB培養(yǎng)基中,加入1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導2 h。超聲5 s,間隔5 s,超聲破碎20 min,通過SDS-PAGE 電泳發(fā)現(xiàn)Hrc N 蛋白主要存在于沉淀中,經(jīng)Ni-NTA sefinose Column層析柱純化,250 mmol/L 咪唑洗脫。該蛋白表達為包涵體,將洗脫液在TGE(Tris-甘氨酸-EDTA)緩沖液中進行透析復性。復性的Hrc N 蛋白利用孔雀綠磷酸酶檢測試劑盒測定其活性,按照Lorenz 和Büttner[13]的方法分別測定1、5、10、15、20、25和30 min時的吸光度,測定波長為650 nm,將測定的吸光度與磷酸鹽標準曲線的吸光度進行比較。

1.3 青枯菌HrcN 蛋白亞細胞定位

1.3.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)CBM613 菌株hrc N基因序列及p RI-eGFP 多克隆位點設(shè)計引物 (5′→3′),L2035:TCTTCACTGTTGATA CATATGATGACCCATCTCGCGCTGCT,下劃線為NdeⅠ酶切位點;L2036:GCCCTTGCTCACCATGGATCCTGCCAGTGCGATCTCGTCA,下劃線為BamHⅠ酶切位點。下劃線前面是p RI-eGFP載體序列,后面是hrc N基因序列。以青枯菌CBM613菌株基因組DNA 為模板進行PCR 擴增,測序后將電泳回收的PCR 產(chǎn)物與NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切的p RI-eGFP質(zhì)粒無縫克隆構(gòu)建重組載體p RI-eGFP-hrc N。以L2035/L2036為p RI-eGFP-hrc N載體進行引物鑒定,并送蘇州金維智生物科技有限公司測序。

1.3.2 蛋白亞細胞定位 提取p RI-eGFP-hrc N重組質(zhì)粒與空載體p RI-eGFP,化學轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 后,擴繁農(nóng)桿菌28 ℃培養(yǎng)至OD600=0.3,用等體積的緩沖液懸浮,室溫靜置4～6 h,然后由下表皮注射到煙草葉片中,繼續(xù)培養(yǎng)4～6 d,用激光共聚焦顯微鏡直接觀察葉片的熒光情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 p ET30a-hrcN 陽性克隆菌落PCR鑒定

使用L2024/L2025 引物對,以青枯菌DNA為模板,擴增出hrc N基因片段,長度為1 320 bp(圖1)。

圖1 青枯菌CBM613菌株hrcN 基因的擴增Fig.1 PCR amplification of hrc N of Ralstonia solanacearum isolate CBM613

p ET30a-hrc N原核表達載體構(gòu)建完成后,挑取在Kan抗性平板上生長的菌落進行PCR 鑒定。若載體與目的基因連接,則出現(xiàn)1 350 bp左右的條帶(圖2)。測序結(jié)果證實hrc N基因與p ET30a原核表達載體連接成功。

圖2 PCR 擴增鑒定pET30a-hrcN 陽性克隆菌落Fig.2 Identification of pET30a-hrc N positive colonies based on PCR amplification

2.2 p ET30a-hrc N 融合蛋白誘導表達

挑取p ET30a-hrc N陽性克隆接種于含Kan(50μg/m L)的LB 液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min培養(yǎng)后,加入1 mmol/L IPTG 誘導表達蛋白,從SDS-PAGE蛋白電泳圖可以看出,2 h即可誘導表達出Hrc N 蛋白,對照和上清液中的Hrc N 蛋白很少,主要存在于沉淀中,Hrc N 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為47 ku左右,表達的蛋白主要以包涵體形式存在(圖3)。純化的Hrc N 蛋白大約1 mg(圖4)。

圖3 融合蛋白誘導表達的SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE of expression of protein induced by IPTG

圖4 HrcN 蛋白純化Fig.4 Purification of HrcN protein

2.3 HrcN 具有ATP酶活性

利用孔雀綠磷酸酶檢測試劑盒測定Hrc N 蛋白的活性,發(fā)現(xiàn)Hrc N 蛋白水解ATP酶與時間呈線性關(guān)系,每微克蛋白質(zhì)每分鐘釋放0.4 nmol左右的磷酸鹽(圖5)。結(jié)果表明HrcN 蛋白作為一種ATP酶,可以在胞內(nèi)水解ATP,為分泌過程提供能量。

圖5 HrcN 蛋白活性Fig.5 Activity of HrcN protein

2.4 PCR鑒定p RI-eGFP-hrc N 陽性克隆菌落

使用L2035/L2036引物對,以青枯菌DNA為模板,擴增出hrc N基因,長度為1 320 bp(圖6)。

圖6 PCR 擴增青枯菌CBM613的hrc N 基因Fig.6 PCR amplification of hrcN of Ralstonia solanacearum isolate CBM613

p RI-eGFP-hrc N 蛋白亞細胞定位載體構(gòu)建完成后,挑取在Kan抗性平板上生長的菌落進行PCR 鑒定,若載體與目的基因連接,則出現(xiàn)1 360 bp左右的條帶(圖7)。測序證實hrc N基因與p RI-eGFP-hrc N 蛋白亞細胞定位載體連接成功。

圖7 PCR 鑒定pRI-eGFP-hrcN 陽性克隆菌落Fig.7 Identification of p RI-eGFP-hrcN positive colonies based on PCR amplification

2.5 亞細胞定位熒光檢測

p RI-eGFP-hrc N重組質(zhì)粒和空載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后,擴大培養(yǎng),由下表皮注射到煙草葉片中,用激光共聚焦顯微鏡觀察葉片的熒光。煙草自發(fā)光比對分析表明,Hrc N 蛋白部分在葉綠體表達,根據(jù)煙草細胞形態(tài)分析,部分在細胞內(nèi)膜和細胞質(zhì)表達(圖8),與蛋白亞細胞定位預測結(jié)果基本一致。

圖8 HrcN 蛋白在煙草表皮的亞細胞定位Fig.8 Subcellular localization of HrcN protein in tobacco epidermal cell

3 討論

T3SS是一種蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng),通常將效應蛋白注入寄主細胞中,跨膜的T3SS裝置與一種可能為分泌過程提供能量的ATP 酶有關(guān),且依賴于ATP 酶的活性催化蛋白質(zhì)的去折疊[17]。T3SS效應蛋白的分泌由跨病原菌細胞內(nèi)膜和外膜的轉(zhuǎn)位酶催化,需要與F1/V1 ATPase同源的親水性T3SS組分存在。

Hrc N 蛋白作為植物病原菌T3SS的結(jié)構(gòu)蛋白之一,可利用水解ATP 產(chǎn)生的能量重塑多種蛋白底物,因此在膜融合、蛋白質(zhì)修飾和降解等多種生理活動中發(fā)揮重要的作用[12]。與其他T3SS相關(guān)的ATP酶一樣,Hrc N 與F0/F1 ATPase亞基同源,包含介導ATP 結(jié)合和水解的Walker框[18]。蛋白互作研究顯示,Hrc N 與T3SS 底物特異性開關(guān)蛋白HpaC以及分子伴侶HpaB相互作用,促進多種效應蛋白的分泌。體外伴侶試驗顯示Hrc N 以ATP 依賴的方式解離T3SS分子伴侶HpaB和效應蛋白Xop F1之間的復合物,表明Hrc N 參與了HpaB結(jié)合效應蛋白的釋放。同時,效應蛋白的釋放依賴于Hrc N 磷酸鹽結(jié)合環(huán)中保守的甘氨酸殘基,這對酶活性和蛋白質(zhì)功能有重要影響。然而,不依賴HpaB 高效分泌的T3SS易位子和菌毛蛋白也需要Hrc N[13]。此外,除了T3SS 中的invC和hrc N基因表達ATP酶,還有一些與ATP酶有關(guān)的基因,其中有3個直接表達ATP 酶,編號分別為 Aave2163、Aave1249和Aave1063,T3SS中轉(zhuǎn)運蛋白所需的能量可能從這3 個ATPase基因中獲得[19]。大腸桿菌ATP酶Esc N 以及中心柄Esc O 的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)顯示,Esc N 具有旋轉(zhuǎn)ATP 酶的不對稱性[20]。原核表達結(jié)果發(fā)現(xiàn)青枯菌Hrc N蛋白主要存在于沉淀中,表達的蛋白主要以包涵體形式存在。ATP 酶活性測定結(jié)果顯示Hrc N 蛋白作為一種ATP酶,可以在胞內(nèi)水解ATP為分泌過程提供能量,蛋白注射接種番茄葉片顯示Hrc N蛋白對番茄葉沒有過敏反應,上述結(jié)果表明Hrc N 是T3SS的結(jié)構(gòu)蛋白之一。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能單獨發(fā)揮生理功能,而需要與其他蛋白互作形成復合體。基于互作蛋白的作用機理,研究蛋白間互作網(wǎng)絡(luò)才能全面闡明靶標蛋白的生理功能[21]。關(guān)于Hrc N 是單獨完成還是與其他蛋白協(xié)同完成ATP 的水解需要通過酵母雙雜交、免疫共沉淀(CO-IP)和Pull-down等蛋白互作技術(shù)進一步研究。

蛋白亞細胞定位是基因功能研究的主要內(nèi)容之一,對全面認識目的蛋白的形態(tài)建成、作用機制以及調(diào)控機理等具有參考意義。目前蛋白亞細胞定位的主要手段有生物信息學預測、免疫組織化學定位、蛋白組學技術(shù)、熒光蛋白定位、共分離標識酶定位等。Hrc N 是一種ATP 酶,通過催化ATP的水解為效應蛋白的分泌提供能量[12],蛋白亞細胞定位結(jié)果顯示HrcN 蛋白可能定位于葉綠體、細胞內(nèi)膜或細胞質(zhì)。根據(jù)試驗結(jié)果和已有的文獻報道,推測Hrc N 是一種定位于細胞內(nèi)膜的外周蛋白,但還需要通過細胞內(nèi)膜特異性染料證實。至于為什么Hrc N 蛋白在葉綠體和細胞質(zhì)表達,可能與葉綠素和細胞質(zhì)中的線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器膜上也存在ATP 酶有關(guān),可通過特異性細胞器染料定位進一步確定。