沙地柏根際促生耐寒短桿菌SDB5的分離和功能鑒定

王建武,相微微,陳 花,王一昭,劉 暢,屈香香,王 鵬,尚愛軍

(榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,陜西 榆林 719000)

沙地柏(Sabina vulgaris),又稱臭柏,柏科圓柏屬的一種灌木,主要分布在中國西北天山、祁連山等地區(qū),其耐干旱貧瘠環(huán)境,有較強的適應(yīng)性,在西北地區(qū)被用來防風固沙,凈化環(huán)境,保持水土,改良土壤等[1]。植物根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR),是指生活在根系土壤周圍或者在植物根際中附生的有益菌[2]。PGPR 定殖于植物根際系統(tǒng),有改善土壤,固氮,解磷,促進植物生長,提高作物產(chǎn)量,提高植物耐受性,防治害蟲,分泌植物激素等作用,在植物快繁中也具有較大的應(yīng)用潛力[3-5]。不同種類的PGPR 與不同植物互作產(chǎn)生的促生效果也有很大差異。李永斌等[6]研究發(fā)現(xiàn)不同菌株在小麥株高、鮮質(zhì)量及增產(chǎn)效果上差異較大,其中枯草芽胞桿菌56在減施尿素10%的條件下使小麥產(chǎn)量提高10.4%。吳東升[7]對7種PGPR 研究發(fā)現(xiàn),不同種類的PGPR 在促進西瓜生長、改善元素吸收及品質(zhì)改良效果上有差異;謝雨歆等[8]發(fā)現(xiàn)3種PGPR 混合菌劑可改善烤煙的農(nóng)藝性狀及煙葉的化學(xué)品質(zhì),同時降低烤煙的發(fā)病率。金月波[9]和祝凌云[10]分別發(fā)現(xiàn)不同菌株在促進水稻種子萌發(fā)、幼苗生長方面都有差異。

土地鹽堿化是影響植物生長與作物產(chǎn)量的重要問題之一,目前中國鹽堿化土地面積還在逐年增加[11]。土地鹽堿化對植物有嚴重的危害作用。土壤鹽堿成分過高會導(dǎo)致土壤p H 增高,影響植物對某些元素的吸收,導(dǎo)致植物缺失營養(yǎng)元素,同時還會造成植物生理干旱,危害植物生長發(fā)育;會抑制水稻種子的萌發(fā)與生長,影響穎花數(shù)量與幼穗分化;會干擾氣孔閉合,影響二氧化碳進出與植物的光合作用,導(dǎo)致植物生長發(fā)育減緩與產(chǎn)量降低[12-15]。PGPR 在改良土壤,促進植物增產(chǎn),以及提高作物耐受性和治理土地鹽堿化方面,已經(jīng)表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢與顯著效果[4]。姜煥煥等[16]研究表明,PGPR 通過調(diào)節(jié)植物鹽堿抗性相關(guān)基因及蛋白的表達,可以增強植物的抗鹽堿能力。添加耐鹽堿PGPR 已逐漸發(fā)展成一種新的緩解鹽堿脅迫的處理方法。劉佳莉等[17]和龐學(xué)兵等[18]分別發(fā)現(xiàn)具有ACC脫氨酶活性的植物促生菌可促進燕麥和棉苗的生長并提高其鹽堿抗性。袁海等[19]研究發(fā)現(xiàn)在不同濃度NaCl脅迫下不同種類的芽孢桿菌使植株的株高、地上部及根系鮮質(zhì)量增加,并降低了玉米葉片的相對電導(dǎo)率。王華笑等[20]和陳小娟等[21]分別發(fā)現(xiàn)根際促生芽孢桿菌能增強玉米的耐鹽脅迫能力。

利用PGPR 進行土壤改良并促生、增產(chǎn)已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)研究中的一個熱點。本試驗擬從沙地柏中分離PGPR,對其形態(tài)和特性進行鑒定,并在盆栽和大田條件下研究其對水稻種子萌發(fā),植株耐鹽堿脅迫及生長、產(chǎn)量等方面的影響,以明確其功能,以期為改良鹽堿地,提高鹽堿地效益,增加作物產(chǎn)量提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

沙地柏采自陜西省神木市大保當鎮(zhèn)沙地柏天然林中,采集其根部,放入自封袋冷藏并帶回實驗室,保存于4 ℃冰箱,備用。水稻品種選用‘吉宏6號’,由寧夏原種場提供。

1.2 方法

1.2.1 沙地柏內(nèi)生細菌的分離及鑒定 沙地柏根部表面消毒后進行沙地柏內(nèi)生細菌的分離與純化,再進行沙地柏內(nèi)生細菌的生長特性觀察及生理生化鑒定,內(nèi)生細菌的16S rDNA 序列測定及分析,內(nèi)生細菌耐鹽耐堿測定均參照艾銀婷[22]關(guān)于沙地柏根際促生細菌玫瑰色考克氏菌SDB9的分離及鑒定的方法。

1.2.2 菌體激素測定 LB 培養(yǎng)基(Luria-Bertani培養(yǎng)基,胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L)培養(yǎng)細菌1 d后,離心收集菌體,送至中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所進行激素含量測定。

1.2.3 水稻種子萌發(fā)及植株生理指標測定 (1)

種子萌發(fā)率測定:先用1×107cfu/m L 目標菌液和蒸餾水分別浸種48 h后,撈出陰干。選取直徑為15 cm 的培養(yǎng)皿32個,鋪上濾紙,分別用150 m L 濃 度 為0.02 mol/L、0.04 mol/L 和0.06 mol/L的Na2CO3溶液模擬輕、中、重度鹽堿脅迫培養(yǎng)接菌和未接菌的種子各100 粒,重復(fù)4 次。14 d后,記錄不同處理種子的萌發(fā)率,從而確定水稻種子所能耐受的鹽堿脅迫濃度。

(2)植株生理指標測定:梯度Na2CO3模擬鹽堿脅迫試驗發(fā)現(xiàn),重度脅迫下,水稻種子有40%以上能正常出芽生長。選取長為30 cm,寬20 cm,高8.7 cm 的方形花盆,將蛭石與營養(yǎng)土按1∶2 的體積比混合后裝盆,每盆裝2 kg土。播種,待水稻幼苗高約5 cm 時間苗,每盆留20株,選取24盆幼苗,用1×107cfu/m L 目標菌液和自來水分別澆灌處理12盆(每盆澆灌1 L),即為試驗組和對照組。30 d后,對試驗組和對照組分別進行3 次鹽堿(每盆澆灌1 L 濃度為0.02 mol/L、0.04 mol/L 和0.06 mol/L 的Na2CO3溶液)脅迫,間隔時間為7 d,3次脅迫處理后,繼續(xù)培養(yǎng)5 d,然后測定對照組和試驗組的水稻葉綠素含量及氧化應(yīng)激生理指標。耐鹽堿相關(guān)指標測定參照艾銀婷[22]的測定方法。

1.2.4 大田試驗 (1)試驗地概況及試驗設(shè)計:試驗地位于寧夏回族自治區(qū)銀川市興慶區(qū)兵溝黃河大 橋,地 處38°24′43″N,106°27′24″E,海 拔1 105 m,年平均降水量200 mm,無霜期168 d,年平均有效積溫3 300 ℃。土壤類型為潮灌淤土,土壤肥力中等。土壤養(yǎng)分含量為有機質(zhì)3.22 g/kg,全氮0.21 g/kg,水解氮17.28 mg/kg,速效磷1.19 mg/kg,速效鉀40.05 mg/kg。挑選顏色和大小基本一致且飽滿的水稻種子1 kg,平均分成兩組,分別用1×107cfu/m L 目標菌液和等量清水浸泡過夜,陰干,備用。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計,分2個處理:試驗組和對照組,每個處理3個重復(fù)小區(qū),每個小區(qū)面積為20 m2,長5 m,寬4 m,條播播種量為160 g,行距20 cm。四周設(shè)4行保護行。以后均按傳統(tǒng)水稻種植方式進行管理。10月份水稻成熟后,放干稻田中的水,晾曬1周。

(2)土壤含鹽量及p H 測定:在播種前,分別從試驗組和對照組的每個小區(qū)中部位置取深度為0～20 cm 土壤,參照鮑士旦[23]的方法進行含鹽量及p H 測定。

(3)水稻形態(tài)指標測定:記錄水稻的出苗率及出苗期,并在成熟期選擇20個單株測定水稻株高、穗長、穗下莖長、穗基直徑、莖基直徑等地上部分指標及根長、根面積、根體積等地下部分指標。

(4)水稻產(chǎn)量指標測定:從各試驗樣地中選擇長勢均勻的1 m2水稻樣本進行采收,測定千粒質(zhì)量,單位平方米產(chǎn)量,重復(fù)3次,取平均值后計算理論產(chǎn)量(換算成14%含水率)。

(5)水稻根部形態(tài)指標測定:用根系掃描儀掃描,然后用Win RHIZO PRO 2009 軟件(Regent Inc.,Quebec,Canada)進行形態(tài)指標的量化處理分析。

1.3 試驗數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0與Microsoft Excel 2016軟件進行統(tǒng)計分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌的分離及鑒定

2.1.1 內(nèi)生細菌的形態(tài)及菌落特征 從沙地柏根中分離提純到1株植物根際內(nèi)生細菌,編號為SDB5,高分辨率掃描結(jié)果顯示該菌長約為2 667 nm,寬約為906.7 nm,桿狀(圖1-A),革蘭氏染色陽性(圖1-B),在p H 7的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后,菌落呈白色。

圖1 內(nèi)生細菌SDB5的形態(tài)鑒定Fig.1 Morphological identification of endophytic bacteria SDB5

2.1.2 SDB5菌16S r DNA 序列分析 以內(nèi)生細菌SDB5的16S r DNA 序列為探針,登錄NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫,進行BLAST 序列比對,結(jié)果表明內(nèi)生細菌SDB5的16S r DNA 序列與耐寒短桿菌Brevibacterium frigoritoleransstrain QT343(登錄號MT043730.1)和Brevibacterium frigoritoleransstrain TS20(登錄號MN710443.1)16S r DNA 序列的同源性最高(100%),因此內(nèi)生細菌SDB5被鑒定為耐寒短桿菌(Brevibacterium frigoritolerans)。

2.1.3 SDB5菌耐鹽耐堿測定 利用不同鹽濃度和p H 的固體LB 培養(yǎng)基,對菌液梯度稀釋后進行滴板試驗(Drop test)(圖2-A,圖2-B),結(jié)果表明耐寒短桿菌SDB5 能夠在濃度為0～1 mol/L NaCl培養(yǎng)基或p H 6～11 培養(yǎng)基上正常生長。在濃度為1.5 mol/L NaCl的培養(yǎng)基上不能生長,在p H 12的培養(yǎng)基上基本不能生長。鹽堿復(fù)合脅迫與上述單獨脅迫結(jié)果類似,說明耐寒短桿菌SDB5具有耐鹽堿能力,且在酸性(p H 6)條件下也能生長。

圖2 耐寒短桿菌SDB5的耐鹽堿測定Fig.2 Identification of salt and alkali tolerance of Brevibacterium frigoritolerans SDB5

2.2 菌體激素含量測定

氣相質(zhì)譜測定其激素含量結(jié)果表明(表1):SDB5菌株內(nèi)生長素(IAA)含量為356.90 ng/g,細胞分裂素主要是異戊烯基腺苷(iPR)和異戊烯基腺嘌呤(iP),其含量分別為2.13 ng/g和48.57 ng/g,而反式玉米素類細胞分裂素如反式玉米素(tZ)、反式玉米素核苷(tZR)、和反式玉米素-7-糖苷(t Z7G)含量很少。

表1 SDB5菌體內(nèi)細胞分裂素(CTKs)和生長素(IAA)含量(ˉx±s)Table 1 Contents of cytokinins(CTKs)and auxin(IAA)of SDB5 strain ng/g

2.3 水稻種子萌發(fā)及植株形態(tài)、生理指標測定結(jié)果

2.3.1 種子萌發(fā)結(jié)果 如表2所示,SDB5菌處理的種子在非脅迫下,14 d 后的發(fā)芽率提高4.3%,鹽堿脅迫下,14 d 后的總發(fā)芽率都有降低;隨著Na2CO3濃度的升高,種子的發(fā)芽率逐漸降低,但相同脅迫濃度下,SDB5菌處理種子的萌發(fā)率高于CK,低鹽堿脅迫下,種子的發(fā)芽率比CK 高2.1%,中度鹽堿脅迫下,種子的發(fā)芽率比CK 高4.5%,重度鹽堿脅迫下,種子的發(fā)芽率比CK 高15.2%,差異顯著。結(jié)果說明在鹽堿脅迫下,SDB5菌能增強水稻種子的萌發(fā)率,但重度脅迫使種子的萌發(fā)率低于60%,嚴重影響種子的發(fā)芽率。

表2 鹽堿脅迫下處理14 d后種子萌發(fā)情況統(tǒng)計(ˉx±s)Table 2 Statistics of germination rate of seeds under saline-alkali stress after 14 days

2.3.2 水稻形態(tài)及生理指標測定結(jié)果 (1)盆栽水稻形態(tài)比較:從圖3可以看出,用菌處理60 d的水稻植株比對照葉片相對較綠,分蘗能力更強。

圖3 鹽堿脅迫下SDB5處理和CK 水稻表型對比Fig.3 Phenotypic comparison of rice between SDB5 and CK under saline alkali stress

(2)水稻生理指標測定結(jié)果:結(jié)果如圖4 所示:SDB5組葉綠素含量顯著高于CK,提高90%(圖4-A),超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性高于CK,但差異并不顯著(圖4-B,圖4-C),過氧化氫酶(CAT)活性顯著高于CK,提高95%(圖4-D),丙二醛(MDA)含量高于CK,但差異不顯著(圖4-E),脯氨酸含量顯著高于CK,提高73%(圖4-F)。

圖4 鹽堿脅迫下SDB5處理和CK 水稻氧化應(yīng)激生理指標測定結(jié)果Fig.4 Determination of physiological indexes of rice oxidative stress in SDB5 treated and CK under saline-alkali stress

2.4 大田試驗結(jié)果

2.4.1 水稻出苗及形態(tài)指標測定結(jié)果 如表3所示:耐寒短桿菌SDB5組與CK 相比,水稻出苗期沒有明顯變化,但出苗率提高20%,株高增加3.8%,穗長增加12.4%,穗下莖增長3.9%;莖基直徑增加2.9%,穗基直徑增加48%,穗基直徑、穗長差異顯著,株高、穗下莖長、莖基直徑差異不顯著;根部形態(tài)指標中側(cè)根數(shù)量明顯增多,根長增加43%,根表面積增加46%,根系體積增大33%。2.4.2 水稻產(chǎn)量指標測定結(jié)果 由表4可知,與CK 相比,SDB5組的穗實粒數(shù)增加33.3%,差異顯著;水稻理論產(chǎn)量為622 kg,CK 理論產(chǎn)量為527 kg,增產(chǎn)18.2%。

表3 SDB5與CK 水稻形態(tài)指標測定結(jié)果(ˉx±s)Table 3 Morphological index results of SDB5 and CK rice

表4 SDB5與CK 水稻產(chǎn)量指標測定結(jié)果(ˉx±s)Table 4 Results of rice output indexes of SDB5 and CK

3 討論

植物內(nèi)生菌的分離及應(yīng)用可以針對同種植物,如王秋平[24]和韓笑[25]對水稻根際內(nèi)生菌的分離及應(yīng)用,也可以針對不同種的植物,如袁東[26]將月季來源的內(nèi)生耐鹽菌株應(yīng)用到水稻中。筆者所在團隊則是從陜北抗逆性極強的沙地柏根際中分離出兩株內(nèi)生促生菌,一株鑒定為玫瑰色考克氏菌(Kocuria rosea),命名為SDB9[22,27],另一株即為本試驗的研究對象,鑒定為耐寒短桿菌,命名為SDB5[28]。研究發(fā)現(xiàn),SDB5菌的耐鹽堿性雖然低于SDB9[22,27],但在p H 11,1 mol/L NaCl條件下能生長,說明耐鹽堿性較強。雖然兩個菌株來源相同,但菌體內(nèi)激素含量有明顯差異,SDB5菌株內(nèi)IAA(生長素)含量為356.9 ng/g,比SDB9菌體內(nèi)IAA 含量低95.4%,細胞分裂素主要成分相同,反式玉米素類細胞分裂素含量均很少,但異戊烯基腺苷(iPR)含量為2.13 ng/g,比SDB9菌少92.6%,而異戊烯基腺嘌呤(iP)為48.57 ng/g,比SDB9菌高33.4倍[20,25]。說明即使來源相同的不同菌株在分泌激素方面,如生長素、細胞分裂素等,種類及含量均存在較大差異,促生機理也應(yīng)存在較大差異。

在梯度Na2CO3模擬鹽堿脅迫下,SDB5 菌能提高水稻的萌發(fā)率并能顯著提高水稻中葉綠素含量,增強水稻光合作用,這與前人對根際促生菌的研究結(jié)果相一致[23-25]。SDB5菌能使水稻葉片中氧化應(yīng)激酶SOD、POD、CAT 活性增加,其中CAT 活性顯著增加,SOD 和POD 活性稍微增加,但與對照差異不顯著;這些抗氧化酶活性的增強,減少了水稻中活性氧的積累,促進了植株的正常生長。脯氨酸含量顯著增加,說明SDB5菌能誘導(dǎo)植物提高脯氨酸含量來抵御外界環(huán)境脅迫。MDA 含量稍微增加,但與對照差異不顯著。綜上,說明耐寒短桿菌SDB5可以提高水稻植株的耐鹽堿性,主要是通過減輕鹽堿脅迫對葉綠素合成的抑制、誘導(dǎo)滲透脅迫調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸的增加,來提高水稻耐鹽堿性,這與前人對PGPR 的研究結(jié)果相一致[26]。有些研究表明PGPR 能在正常生長條件下增強植物抗氧化酶的活性,但脅迫下抗氧化酶活性降低[24-25],與本試驗結(jié)果不一致,原因可能是不同內(nèi)生菌對植物氧化應(yīng)激能力的影響有差異,具體機理還需進一步研究。

大田試驗條件下,在p H 8以上的堿性土壤中,接種SDB5菌水稻植株地上及地下生物量均增加:穗基直徑及穗長顯著增加,根長、根表面積及根體積也顯著增加。對經(jīng)濟性狀而言,千粒質(zhì)量稍有降低,穗實粒數(shù)增加,理論產(chǎn)量提高18.2%,增產(chǎn)效果顯著。上述研究進一步證明在鹽堿化土壤中,SDB5 菌能成功定殖到水稻根部并發(fā)揮促生、增產(chǎn)作用。

4 結(jié)論

本試驗從沙地柏根中分離到1株耐寒短桿菌SDB5。該菌株內(nèi)IAA(生長素)和細胞分裂素中的異戊烯基腺嘌呤(iP)含量較高,而反式玉米素類含量很少。該菌能夠在濃度0～1 mol/L NaCl培養(yǎng)基或p H 6～11培養(yǎng)基上正常生長。鹽堿復(fù)合脅迫與上述單獨脅迫結(jié)果類似,說明該菌有耐鹽堿能力。梯度Na2CO3模擬鹽堿脅迫下,該菌能使水稻萌發(fā)率提高,葉綠素含量、CAT 活性、脯氨酸含量均顯著提高,說明該菌能增強水稻的耐鹽堿性。大田試驗結(jié)果表明:在土壤含鹽量0.22%,p H 8.4輕度鹽堿地上,該菌能使水稻地上和地下部分生物量增加,尤其是穗基直徑顯著增粗,穗長、根長、根面積、根體積顯著增加,水稻理論產(chǎn)增加18.2%,證明SDB5菌不僅促進水稻生長還能提高水稻產(chǎn)量。綜上所述,沙地柏的內(nèi)生耐寒短桿菌SDB5可以提高水稻耐鹽堿性,并在鹽堿條件下,使水稻的生長勢增強,產(chǎn)量提高。

本研究成功分離了耐寒短桿菌SDB5,并證明其在鹽堿條件下,對水稻有促生、增產(chǎn)效果,這一研究結(jié)果為開發(fā)新型微生物菌劑,提高鹽堿地效益,促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了新的途徑。