青稞籽粒花青素合成相關基因HvnF3'M 的克隆與表達分析

王 燕,姚曉華,姚有華,蘇樂平,2,安立昆,吳昆侖

(1.青海大學,青海省農林科學院,青海省青稞遺傳育種重點實驗室,國家麥類改良中心青海青稞分中心,西寧 810016;2.延安市農業科學研究所,陜西 延安 716000)

青稞(Hordeum vulgareL.var.nudumHook.f.)也稱裸大麥,屬禾本科大麥屬作物,為禾本科1～2 a生草本植物,可分為二棱、四棱和六棱,是大麥的一個變種[1-2]。因其具有抗寒、耐旱、抗逆性強等特點,被廣泛種植于西北、西南等高原地區[3]。青稞的營養價值較高,具有“三高兩低”的營養特點,其中,“三高”是指高纖維、高蛋白、高維生素;“兩低”是指低脂肪、低糖,因此長期食用青稞對人體營養膳食結構有極大益處[4]。青稞還含有多酚類物質、黃酮類物質和β青葡聚糖等有益成分,對于降膽固醇、降血糖血脂有一定的作用,因此青稞的營養保健功能現已成為國內外研究的熱點[5]。中國青稞品種資源豐富,由于不同色素在青稞種子的果皮和糊粉層內沉積而導致不同顏色的呈現,目前帶顏色的青稞主要分為藍、黑、紫3種[1]。與普通青稞相比,有色青稞富含花色苷、酚類化合物、蛋白質以及一些微量元素等有益成分,這也使得目前對于有色青稞的研究越來越受到重視[6]。

花青素(Anthocyanins)又稱為花色苷,主要是作為水溶性色素,廣泛存在于蔬菜、水果和有色麥類和其他植物中,也是使組織呈現特定顏色的主要次生代謝產物之一[7-8]。花青素是形成谷物籽粒顏色的主要色素成分,具有預防心腦血管疾病、癌癥、保護肝臟等保健功能[9-10],可應用于醫藥保健行業,還可作為著色劑等應用于食品行業[11]。在高海拔地區,花青素還可抵御紫外線輻射,避免對植物造成損傷[12]。近年來隨著人們對富含花青素的谷物需求越來越多,有色大米和玉米因其花青素含量高而被用作天然的功能性材料[13]。目前花青素在擬南芥、玉米等植物體內的合成途徑已經研究得較為清楚,其主要由黃酮3′羥化酶(F3′H)、查爾酮合成酶(CHS)、黃烷酮3-羥化酶(F3 H)、查爾酮異構酶(CHI)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等多種酶催化完成[14]。然而,青稞紫粒中花青素的合成相關基因及其調控機制研究較少。

類黃酮3′單加氧酶(flavonoid 3′-monooxygenase,F3′M)屬于植物細胞色素P450家族(cytochromeP450,CYP450,CYPs)。早 在1986 年Larson等[15]從玉米中分離了F3′M基因,該基因的鑒定確立了玉米中黃酮類化合物生物合成的另一個反應。然而F3′M基因在其他植物中的相關研究鮮見。CYP450是迄今為止支持植物代謝最大的酶家族,在植物體內參與多種重要的代謝反應[16]。CYP450還參與了生物體內脂肪酸偶聯物、植物激素、防御化合物等生物的合成與分解代謝[16-17]。在植物的生長發育、抵御生物和非生物脅迫過程中CYP450 也發揮著重要的作用[18]。目前細胞色素P450參與花青素合成相關研究主要集中在模式植物和藥用植物中,在青稞粒色形成中的研究尚無報道[16]。因此,本研究基于前期紫色青稞的GBS(Genotyping-by-sequencing)基因定位結果,從紫粒青稞‘達章紫’和白粒青稞‘昆侖12號’中克隆了CYP450 類基因F3′M,并對其序列進行了分析,利用實時熒光定量PCR(RTqPCR)檢測了F3′M基因在紫粒和白粒青稞種子著色過程中的表達模式。研究結果為F3′M基因在花青素合成中的調控研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以紫粒青稞品種‘達章紫’與白粒青稞品種‘昆侖12號’為材料,2020年4月栽種于青海大學農林科學院青稞實驗基地。在籽粒著色不同時期:播種后11周(早期)、13周(中期)和15周(晚期)取兩品種籽粒種皮,3次生物學重復。所有樣品經液氮中速凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存,備用。

1.2 方法

1.2.1 青稞籽粒種皮總RNA 的提取及cDNA合成 將青稞籽粒種皮在液氮中快速研磨至粉末狀,對‘達章紫’與‘昆侖12 號’進行總RNA 提取,采用北京麥瑞博生物科技有限公司RNA 試劑盒(Ta KaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit),用超微量核酸蛋白測量儀(NanoPhotometer)對2個品種的RNA 進行濃度和純度測定,并借助1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測其RNA完整性。樣品總RNA 的反轉錄,完全按照c DNA 合成試劑盒(PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)的操作步驟進行,并置-80 ℃保存,備用。

1.2.2 青稞HvnF3′M基因的克隆 在青稞紫粒的基因定位結果中,7 H 染色體的候選區段內獲得一個與花青素合成相關的F3′M序列(基因ID:MLOC_6177),命名為Hvn F3′M[19]。利用Primer 5.0 設計該基因引物HvnF3′M-F/R(表1),以青稞種皮cDNA 為模板進行PCR 擴增。PCR 擴增體系及瓊脂糖凝膠電泳檢測方法參考姚曉華等[20]的方法。獲得的目的條帶用DNA 膠回收試劑盒(DNA Gel Extraction Kit)進行切膠回收,用超微量核酸蛋白測量儀(NanoPhotometer)測定膠回收產物的濃度和純度。將回收產物與p Easy-Blunt載體(全式金生物公司)進行連接、轉化至多個大腸桿菌(Escherichia coli)Trans-T1感受態細胞中。最后,將篩選獲得的3個陽性克隆以M13為擴增引物進行菌液PCR,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3 青稞Hvn F3′M基因的生物信息學分析利用NCBI分析Hvn F3′M的保守結構域[21]。利用Expasy Protparma和Protscale預測蛋白質的理化性質和親/疏水性[21]。利用SignalP4.1和TMHMM-2.0 預測蛋白質的信號肽和跨膜結構[21]。用Cell-Ploc 2.0對蛋白質的亞細胞進行初步定位[21]。利用SOPMA 和SWISS-MODEL軟件對青稞Hvn F3′M分別進行二、三級結構預測[21]。采 用 NCBI 中 的 BLASTP 工 具 與Hvn F3′M 蛋白高度同源的其他禾本科植物氨基酸序列進行比對[21]。利用Mega 5.1軟件構建生物系統進化樹[21]。

1.2.4 青稞HvnF3′M基因表達模式分析 根據擴增獲得的Hvn F3′M基因序列,用Primer 5.0設計定量引物HvnF3′M-SF/SR(表1)。以‘達章紫’和‘昆侖12號’播種后11周(早期)、13周(中期)和15 周(后期)的籽粒種皮cDNA 為模板,選擇18Sr RNA 作為內參基因(表1),采用Ta KaRa公司的TB Greenpremix ExTaqⅡ熒光染 料 利 用 Light Cycler480System 進 行 RTqPCR。RT-qPCR 反應體系參照蘇樂平等[21]的方法進行。

表1 研究所涉及的引物情況Table 1 Primers used in this study

1.3 數據處理及分析

表達量數據利用Microsoft Excel 2010 和SPSS 22.0統計軟件分別進行整理分析,以“平均值±標準差(SD)”方式呈現。基因在不同時期青稞品種的相對表達量采用2-ΔΔCt公式進行計算[22]。所有試驗均包含3次生物學重復,試驗數據方差分析采用SPSS 22.0。

2 結果與分析

2.1 HvnF3'M 基因的克隆與序列分析

以‘達章紫’和‘昆侖12 號’的籽粒種皮cDNA 為模板,Hvn F3′M-F/R 為擴增引物,獲得一條全長為1 675 bp的目的條帶(圖1),該基因開放閱讀框為1 584 bp,共編碼527個氨基酸(圖2)。序列比對發現,‘達章紫’與‘昆侖12 號’的Hvn F3′M的核苷酸序列存在兩個差異,分別位于72 bp和957 bp處,兩者一致性為99.87%,導致兩個氨基酸差異,一致性為99.62%。利用NCBI中的CD-search對兩個品種的氨基酸序列進行基因的保守結構域預測,結果表明該基因有血紅素結構域“F××G×R×C×G”,屬于細胞色素P450超家族的CYP75家族(圖3)。

圖1 HvnF3'M 基因的PCR 擴增產物Fig.1 PCR amplified product of HvnF3'M gene

圖2 HvnF3'M 基因的核酸和推導的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide acid sequences and deduced amino acid sequences of HvnF3'M genes

圖3 HvnF3'M 蛋白的保守結構域Fig.3 Conserved domain prediction of HvnF3'M Protein

利用在線工具Protparam 預測其理化性質,結果表明,‘達章紫’中的Hvn F3′M 蛋白分子式為C2561H4085N713O723S18,分子質量為57.01 ku,不穩定指數為35.16,脂溶指數為99.39,理論等電點為6.85,其中負電荷殘基為59個,正電荷殘基為58個。‘昆侖12號’Hvn F3′M 蛋白分子式為C2553H4079N713O720S19,分子質量為56.89 ku,不穩定指數為35.21,脂溶指數為99.39,理論等電點為7.19,其中正、負電荷殘基均為58個(表2)。對Hvn F3′M 蛋白親疏水性、信號肽和跨膜結構預測發現,該蛋白屬于親水性的穩定堿性蛋白,不存在信號肽但存在跨膜結構(圖4和圖5)。亞細胞定位預測其極可能定位在細胞質的內質網中,得分為1.915,而在周質及外層膜分別為0.333和0.044。

圖4 HvnF3'M 蛋白的親水性和疏水性預測Fig.4 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of HvnF3'M protein

圖5 HvnF3'M 蛋白親跨膜結構預測結果Fig.5 Prediction of transmembrane structure of HvnF3'M protein

表2 HvnF3'M 理化性質分析Table 2 Results of physical and chemical properties of HvnF3'M

HvnF3′M 蛋白的二級結構預測結果發現,‘昆侖12 號’蛋白主要二級結構依次為α-螺旋(49.15%)、無 規 卷 曲(35.86%)、延 伸 鏈(10.25%)和β轉角(4.74%);‘達章紫’蛋白主要二級結構依次為無規卷曲(44.97%)、α-螺旋(42.69%)、延伸鏈(12.33%)(圖6)。對F3′M蛋白的三級預測結果表明,Hvn F3′M 蛋白為低聚態單體,含有α-螺旋與無規卷曲結構(圖7)。

圖6 HvnF3'M 蛋白二級結構預測Fig.6 Secondary structure prediction of HvnF3'M protein

圖7 Hvt F3'M 蛋白三級結構預測Fig.7 Tertiary structure prediction of HvnF3'M protein

2.2 HvnF3'M 蛋白的同源比較及系統進化分析

DNAMAN 6.0結果分析表明,Hvn F3′M 蛋白與青稞(Hordeum vulgareL.var.nudumHook.f.)、大麥(Hordeum vulgare)、二粒小麥(Triticum dicoccoides)、山羊草(Aegilops tauschii)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)的F3′M 氨基酸序列一致性較高,分別為99%、100%、88.85%、78.23%和77.52%(圖8)。系統進化分析表明,在11 種禾本科植物種中,青稞F3′M 蛋白與同物種青稞、大麥的親緣進化關系最近,與玉米(Zea mays)的親緣進化關系較遠(圖9)。

圖8 HvnF3'M 與禾本科其他植物多序列比對Fig.8 Multiple alignment of HvnF3'M and other plants of gramineae

圖9 HvnF3'M 蛋白與其他禾本科植物的系統發育分析Fig.9 Phylogenetic analysis of Hvt F3'M protein and other gramineae

2.3 總花青素含量及Hvn F3'M 基因表達分析

對‘達章紫’和‘昆侖12號’粒色形成的3個時期進行粒色表型分析及總花青素含量測定發現,‘達章紫’中總花青素含量呈極顯著升高,中期較早期增加了793.81μg/g,為早期的9.38 倍(P＜0.01),晚期較早期增加了1 173.07μg/g,為早期的13.38倍(P＜0.01);‘昆侖12號’總花青素含量3個時期均無顯著差異(圖10,圖11)。同時為研究Hvn F3′M基因在青稞種皮顏色形成中的表達模式,利用RT-qPCR 檢測該基因在‘達章紫’和‘昆侖12號’種皮顏色形成的早、中、晚期的相對表達量。熒光定量PCR 結果表明,在籽粒顏色形成的早、中、晚期,‘達章紫’的Hvn F3′M基因的表達量在早期與中期無顯著差異,晚期表達量極顯著升高,為早期的1.49倍,中期的1.52倍(P＜0.01);而‘昆侖12號’3個時期Hvn F3′M表達量差異不顯著;且晚期‘達章紫’Hvn F3′M基因的表達量極顯著高于‘昆侖12 號’(P＜0.01)(圖11-B)。推測隨著種皮花青素的合成,Hvn F3′M基因表達量逐漸升高,該基因可能正向調控花青素的累積。

圖10 HvnF3'M 基因在不同粒色青稞種子中的著色過程Fig.10 Coloration of HvnF3'M gene in barley seeds of different grain colours

圖11 不同粒色青稞品種粒色形成的早、中、晚期的表達量及總花青素含量Fig.11 Expression and total anthocyanin content of different hulless barley varieties at early,middle and late stages

3 討論

細胞色素P450單加氧酶家族在生物體內對外源化合物(如工業化學品)的代謝和內源化合物(如維生素)的調節過程都扮演著一個重要的角色[23-25]。本研究從紫粒青稞‘達章紫’和白粒青稞‘昆侖12號’,分別克隆獲得一條細胞色素P450單加氧酶的F3′M基因。發現‘達章紫’與‘昆侖12號’的Hvn F3′M的序列存在兩個堿基和兩個氨基酸的差異。研究表明,生物體內堿基的突變都極大可能影響蛋白質或酶的生物學功能,進而導致機體的表型出現異常。例如,歐春青采用基因組重測序結合BSA 分析的方法,從一種紅色梨品種中鑒定出一個與紅色性狀緊密關聯的14 bp缺失變異,該片段缺失變異促使了PpBBX24基因產生移碼突變,蛋白翻譯提前終止,導致部分蛋白功能出現改變[26-27]。本試驗中的堿基差異是否也與花青素合成相關有待進一步驗證。陸生植物細胞色素P450共有11個氏族,被分為單家族簇和多家族簇兩類,多家族簇其功能具有巨大的多樣性,其中CYP75屬于多家族簇,與類黃酮的合成密切相關,而花青素生物合成途徑是類黃酮途徑的重要分支之一[16,28]。本試驗克隆的F3′M屬于CYP75,因此推測該基因與花青素合成存在一定的聯系。通過對Hvn F3′M 蛋白跨膜結構與信號肽預測結果發現,該蛋白在2種青稞內均存在跨膜結構。跨膜蛋白位于細胞與外界的連接處,對于細胞與外界之間的信號轉導起著重要作用,具有多種生物學功能,該結構的存在對基因功能的研究和探索具有重要意義[29]。亞細胞定位發現,該蛋白均可能定位在內質網中,這與目前諸多研究發現的花青素合成位置具有相同性[30]。

花青素是植物中常見的具有強大抗氧化以及清除自由基等生理功能的代謝產物[31-32]。近年以來,關于F3′M基因在單子葉植物中的研究較少。本實驗通過對Hvn F3′M 蛋白的同源比較分析發現,Hvn F3′M 蛋白與大麥的F3′M 蛋白序列相似性最高,達到了100%,與NCBI上青稞未知蛋白(KAE8766982.1)相似性達到了99%,同源比對發現NCBI上青稞未知蛋白序列可能存在缺失現象,但須進一步驗證。Hvn F3′M 氨基酸序列具有絕對保守的“E××R”基序和典型的“LPPGP”序列,還具有P450超家族最具代表結構域,即血紅素結構域“F××G×R×C×G”,這一特征不僅符合P450超家族蛋白質特征,也與植物花青素合成途徑中的F3′H(flavonoid 3′-hydroxylase)氨基酸序列特點相似[16,32-33]。前人研究發現F3′M蛋白與部分植物(如紅豆杉、云杉等)的F3′H 蛋白序列存在高度相似性,均具有保守結構域(PPGP,AGTDT 和FGAGRRIC)[34]。因 此 本 研究從大麥參考基因組(ftp://ftp.ensemblgenomes. org/pub/release-63/plants/fasta/hordeum _ vulgare/dna) 中 調 取 了 F3′ H(HORVU1Hr1G094880)序列,比較其蛋白的3個保守結構域(PPGP、AGTDT 和FGAGRRIC),與‘達章紫’F3′M 一致性分別為100%、80%和100%,與‘昆 侖12 號’F3′M 一 致 性 分 別 為100%、60%和100%。F3′H 是類黃酮生物合成途徑中的關鍵酶,研究表明F3′H 基因在轉錄水平上的豐度能有效影響花青素的合成[33],推測F3′M 蛋白在花青素合成過程中可能與F3′H 蛋白具有相似功能。

花青素的含量與植物籽粒成熟度之間關系密切,且隨著花青素的累積,部分基因的表達量也會顯著升高[35]。例如,蘇樂平等[21]研究發現,青稞類黃酮3-O-葡萄糖基轉移酶基因(Hvt UF3GT)在藍粒青稞‘INB0N-7’和白粒青稞‘昆侖12號’的籽粒灌漿后期不表達,而在黑粒青稞和紫粒青稞中的表達強弱依次為‘黑老鴉’(黑粒)＞‘昆侖17號’(黑粒)＞‘達章紫’(紫粒)＞‘涅如姆扎’(紫粒)。趙佳等[36]通過比較7種不同顏色月季花瓣中的花青素苷含量以及Rh MYBs4-1和Rh MYBs6-1的表達水平,結果發現紅色花瓣中花青素苷含量顯著高于其他顏色花瓣,其中粉紅色月季花瓣中Rh MYBs4-1的表達量極低,且花青素苷含量不到紅色花瓣的10%。在本研究中,紫粒青稞種皮著色過程中Hvn F3′M基因的表達量極顯著(P＜0.01)高于白粒青稞,此外,在紫粒形成過程中的Hvn F3′M基因表達量隨著粒色的加深,表達量逐漸升高,且在晚期表達量達到了最高,推測Hvn F3′M基因在紫粒形成過程中正向調控了花青素的累積,但具體調控機理有待進一步探索。

4 結論

本研究從青稞‘昆侖12號’和‘達章紫’中克隆了Hvn F3′M基因。該基因全長為1 675 bp,編碼527 個氨基酸,屬于P450 超家族。RT-qPCR結果顯示,該基因在紫色品種‘達章紫’籽粒形成過程中其表達量在晚期顯著升高,在白色品種‘昆侖12號’中則差異不顯著;且在‘達章紫’表達量極顯著高于‘昆侖12號’。因此推測,該基因在青稞籽粒著色過程中發揮重要正向調控作用。本研究結果為進一步探究Hvn F3′M基因在花青素的合成中的作用和調控機制奠定了基礎。