不同因素對蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1標準樣品的影響分析*

魏 杰 王 洪 光姣娜 周佳琪 付 瑞 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

蘋果酸脫氫酶(malic enzyme，ME)和異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydorgenase，IDH)是三羧酸循環及其補充反應中的關鍵酶，在生物體能量代謝、合成及抗氧化過程中發揮著重要作用[1-2]。同工酶家族中ME-1和IDH-1的研究，不僅在生物發酵、種質選育以及腫瘤診療中發揮著重要作用，也是實驗動物遺傳質量控制國家標準中近交系小鼠的重要評價項目[3-6]。

我國檢測機構眾多，一方面有助于加強對產品的質量控制，另一方面由于各機構檢測能力參差不齊。不同機構得到檢測數據的有效性和科學性也為監管和公信帶來了新的問題。因此，制備標準樣品對檢測機構進行能力評定就顯得尤為重要。

本研究制備小鼠腎勻漿來源的ME-1和IDH-1標準樣品，并通過品系差異、凍融、時間溫度、運輸、濃度等因素對標準樣品的影響進行研究，從而為近交系小鼠遺傳質量控制檢測能力評定提供支持。

1 材料和方法

1.1 動物來源

BALB/c和C57BL/6小鼠各10只，8周齡雄性，購自中國食品藥品檢定研究院，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2017-0005；CBA小鼠10只，8周齡雌性，購自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2019-0008】。本單位實驗動物使用許可證號SYXK(京)2017-0013。本實驗經過中國食品藥品檢定研究院實驗動物福利審查，倫理號：中檢動(福)第2019(A)001號。

1.2 儀器

Sartorius 酸度計(賽多利斯公司)，ML4002 電子天平(梅特勒托利多公司), Bead Ruptor 24 Eilte 樣品均質儀(OMNI公司), Thermo Multifuge X1R 離心機(賽默飛世爾公司), LABCONACO 凍干機(labconco公司), 海爾BCD冰箱(青島海爾公司), Thermo恒溫箱(賽默飛世爾公司), BioRad 3000Xi 電泳儀(伯樂公司)、 微量點樣器(北京六一廠)。

1.3 試劑和耗材

滅菌手術器械(上海醫療器械有限公司); Bead Ruptor 勻漿管(OMNI公司)、Greiner 凍存管(格瑞納公司)、凍存保護劑(西格瑪公司);三 羥甲基氨基甲烷與甘氨酸(北京中生瑞泰公司)、ME-1 和 IDH-1 染色試劑盒(本單位自行研制)、醋纖膜(浙江路橋公司)。

1.4 標準樣品的制備

將3個品系實驗小鼠進行CO2安樂死，并分別取腎臟置于燒杯中稱質量，按照W(腎)∶V(水)=1∶2的比例，向Bead Ruptor勻漿管中加入遇冷蒸餾水，并置于Bead Ruptor 24 Eilte樣品均質儀中按照腎勻漿程序勻漿。配平勻漿產物，置于4 ℃離心機中，12 000 r/min離心30 min，分品系分離上清至凍存管，按照7∶3比例加入凍存保護劑，置于凍干機凍干后于低溫冰箱凍存備用。

1.5 均勻性測定程序

先將C57BL/6、BALB/c和CBA三品系小鼠腎勻漿按品系分組。按照4%的比例隨機抽取3個品系標準樣品，每管加入70 μL蒸餾水，混勻后取10 μL加入微量點樣器中，于Tris-Gly 8.5緩沖液浸潤的醋纖膜上點樣并電泳、染色，判讀條帶。緩沖液配置、具體實驗條件及判定標準參見GB/T 14927.1—2008 ME-1和IDH-1項目[6]。

如所得條帶均清晰可讀，且與標準規定一致，即認為符合樣品的均勻性要求。如未通過均勻性檢測，則需重新制樣并檢測，直到符合標準規定。

1.6 時間-溫度、凍融、運輸及濃度對標準樣品影響的測定

1.6.1凍融因素：三品系小鼠標準樣品各取3管，首次測定于-20 ℃冰箱中取出加水還原測定。實驗條件同均勻性測定實驗。所得條帶清晰可讀且與標準一致，則認為一次凍融穩定性良好。初次凍融后，即將試樣放入-20 ℃冰箱冷凍，每隔2 h再次取出，融化點樣測定。結果判讀依據與初次相同。過程中發生拖帶、彌散等情況，終止凍融測定并記錄測定次數。過程中一直穩定，也以3次凍融為測定終點。

1.6.2時間-溫度因素：將C57BL/6、BALB/c和CBA三品系小鼠，以Cxx、Bxx和Axx進行編組。制定一個21 d觀測計劃，統一在各溫度時間點放入待測標準樣品。將時間和溫度設為觀測的橫縱坐標，設定4 ℃，室溫(RT)和37 ℃這3個溫度觀測點，1、2、3、7、14及21 d為觀測時間，在每個坐標交點，每個型別的樣品分別隨機抽取兩瓶進行編號，編號按照“品系-時間-溫度”原則。如C57BL/6的3 d、37 ℃樣品，分別標為C-3-37-1和C-3-37-2。

在取出當天進行檢測。所得條帶清晰可讀且與標準一致，則認為該溫度時間坐標點穩定性良好；所得條帶中任何1條發生條帶模糊不可讀，則認為在該坐標點已經發生了樣品的穩定性變化，記錄不穩定坐標點，且不穩定點出現后的時間溫度觀測點隨之取消。即使一直穩定，本測定的觀測周期也僅為21 d時長。

匯總各型別穩定性結果，填寫時間-溫度穩定性表格。

1.6.3運輸因素：運輸條件每品系兩管，干冰條件冷鏈，北京至沈陽、西安及成都三地往返測試。檢測實驗條件同均勻性測定實驗。條帶清晰可判讀，則認為運輸對穩定性無影響；否則，需要重新調整運輸條件重新測試。

1.6.4濃度因素：濃度因素按照每品系一管進行原倍、1/2、1/4和1/8梯度測試。測試條件同均勻性測定實驗1.5。條帶清晰可判讀，則認為該濃度對穩定性無影響；條帶不可見，則認為該濃度對穩定性有影響。

2 結果

2.1 均勻性測定結果

C57BL/6、BALB/c和CBA三組樣品按照4%的比例分別抽取8管、8管和6管。ME-1均勻性檢測中C57BL/6和CBA組均為b型，BALB/c組為a型。IDH-1均勻性檢測中，C57BL/6和BALB/c組均為a型，CBA組為b型，且與GB/T 14927.1—2008標準規定一致(圖1)，隨機抽樣組內無差別。其中C57BL/6、BALB/c和CBA標準品，以下簡稱C5標、BA標和CB標。

圖1 實驗小鼠腎勻漿中ME-1和IDH-1均勻性檢測結果Fig.1 Uniformity sampling results of ME-1 and IDH-1

2.2 凍融穩定性結果

經1～3次凍融檢驗，C57BL/6、BALB/c和CBA三組樣品的IDH-1仍清晰可判讀，與初次凍融一致。

ME-1第3次凍融結果較前兩次結果，條帶變淡但肉眼可讀，綜合判定為3次凍融對結果判別無影響(圖2)。

圖2 CBA ME-1和IDH-1的3次凍融結果Fig.2 Three-time freeze thawing stability results of ME-1 and IDH-1 in CBA

2.3 時間-溫度因素對穩定性影響的測定

存放穩定性觀察期最長21 d。經實驗測定表明，三品系來源的標準樣品在4 ℃和室溫條件下，均可以穩定存放21 d。在37 ℃條件下，僅能穩定存放2 d，第3天開始降解(圖3)，ME-1和IDH-1均出現拖帶，帶型和第2天和標準結果均有差異，已不可讀。

圖3 BALB/c ME-1和IDH-1 第2～3天37 ℃檢測結果Fig.3 Results of the ME-1 and IDH-1 in BALB/c from the 2nd to 3rd day under 37 ℃

三品系不同個體和不同型別之間沒有顯著差異，時間-溫度存放穩定性匯總結果見表1。

表1 實驗小鼠腎勻漿中ME-1和IDH-1樣品不同溫度時間穩定性結果Table 1 Results of ME-1 and IDH-1 stability under different time and temperature condition

2.4 運輸因素對穩定性影響的測定

經實驗測定表明，三品系來源樣品經在低溫系統運輸往返西安、成都和沈陽，均能穩定存在。圖4為北京往返西安后的測定結果。

圖4 北京-西安往返運輸穩定性檢測結果Fig.4 Transpotation stability results of ME-1 and IDH-1 from Beijing to Xi’an

2.5 不同濃度標準樣品的測定結果

C57BL/6、BALB/c和CBA三種樣品各抽一管，按照原倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍進行梯度稀釋后，蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1各濃度測定結果和原倍一致，且均符合標準規定。1/8倍稀釋，對樣品穩定性無明顯影響。圖5給出了C57BL/6樣品組各濃度梯度的檢測結果。

圖5 C57BL/6 樣品ME-1和IDH-1濃度梯度結果Fig.5 Concentration gradient results of ME-1 and IDH-1 in C57BL/6 mice

3 討論

作為標準物質/標準樣品的重要屬性的均勻性和穩定性受到抽樣方法、測量環境、評價方法等多種因素的影響[7-9]。探討不同因素對標準樣品均勻性和穩定性的作用，以期更為合理的進行檢測評價。

3.1 不同品系來源標準樣品的制備

C57BL/6、BALB/c和CBA是近交系小鼠應用和檢測中最為常見的品系。不同來源腎勻漿樣品的帶型顯色濃度略有差異，C57BL/6和BALB/c來源的ME-1比CBA來源的樣品顯色更清晰，而在IDH-1位點上，3個來源樣品無明顯差異。如果僅制備用以區分兩位點的標準樣品，從動物福利角度，可以僅選用C57BL/6和CBA品系即可。從檢測角度而言，應當熟悉常用品系的表型。

3.2 凍融、時間-溫度、運輸和濃度對樣品穩定性的影響

本研究探討了4種變量因素對樣品穩定性的影響。北京往返沈陽、西安、成都三地約1 400、2 200和3 600 km，運輸條件為干冰，往返時間為2～5 d。收取樣品時，成都往返樣品干冰已無剩余，但樣品并表觀未改變。因此說明非全程低溫長途運輸對兩位點標準樣品無明顯影響。同時，3次凍融以及1/8倍稀釋對標準樣品在ME-1和IDH-1位點穩定性均無影響，但長時間高溫狀態對樣品影響明顯。室溫和4 ℃條件下，標準樣品21 d內均能穩定存在，但在37 ℃條件下僅能穩定存在2 d，耐高溫能力介于酯酶-3(37 ℃、1 d)和過氧化氫酶-2(37 ℃、30 d)之間[10-11]。

3.3 標準樣品制備方案的設計和改進

本研究從檢測常用角度，選取3種品系來源小鼠制備了ME-1和IDH-1標準樣品。在兩位點上，綜合表現為3種帶型，進行能力驗證計劃樣品發放時，可以隨機發放2～3種樣品，形成不同的組合結果。既兼顧了難度和公平，又能夠更好地防止結果串通，有利于反應參與者的真實檢測水平。

樣品具有良好的均勻性和穩定性。除非37 ℃高溫暴露2 d以上會出現不穩定結果。在室溫(約25 ℃)及以下溫度條件可穩定存在21 d。3次凍融且距離在3 600 km以內的干冰運輸方式對1/8倍稀釋樣品的均勻性和穩定性均沒有顯著影響。下一步，將完善在-20 ℃的低溫條件下，長期保存的穩定性研究，從而為標準樣品研制、能力驗證計劃以及測量審核實施提供有力的基礎數據。