無菌鼠模型制作方法與評價*

李建香 王君君 黃天馬 張子健 過偉峰

(1.南京中醫藥大學附屬南京中醫院，南京 210022)(2. 南京中醫藥大學，南京 210023)

隨著微生態學的發展，無菌動物開始廣泛應用于生物學、醫學和藥學領域。制作公認的無菌動物模型是進行各項研究的基礎。無菌動物特別是無菌大鼠、小鼠的成功培育技術成為研究微生物與人類生命現象(健康、疾病)關系的關鍵技術[1-2]。由于無菌動物具有早期生長緩慢、性成熟晚、產仔量少且成活率高、壽命較長、免疫系統發育不良、消化功能差和抗輻射能力強等特點，其在微生物寄生蟲學、免疫代謝學、營養學、老年學、腫瘤學、消化學、神經精神學、放射醫學、毒理和藥理學等研究中發揮舉足輕重的作用[3-5]。

嚴格的無菌動物指在動物體宿主內外任何部位及生活環境中均檢測不出任何細菌、病毒、真菌及寄生蟲的動物。廣義的無菌動物還包括清除腸道中大部分菌群的動物，又稱為偽無菌動物。目前制作無菌鼠的方法主要有：剖腹取胎無菌飼養法制作無菌(germ-free, GF)鼠模型，抗生素雞尾酒法制作偽無菌(pseudo germ-free, PGF)鼠模型。本文對無菌鼠模型制作方法進行歸納總結與評價，以期為科學研究和推廣應用提供參考。

1 剖腹取胎無菌飼養法制作無菌鼠模型

通常認為哺乳動物在母體子宮內處于相對無菌狀態。對無特定病原體(specific pathogen free, SPF)大鼠、小鼠進行剖腹取胎凈化，采用無菌飼養方法培育于無菌隔離器，經人工飼育建立無菌鼠群[6-11]。

1.1 判斷孕鼠分娩日期

母鼠達到體成熟進行交配，通過陰道栓判斷母鼠受孕成功，根據經驗或者以提前交配的同種鼠的孕產期為依據，推斷受孕母鼠的分娩日期。一般于見栓后20.5 d進行剖宮取胎手術，剖得仔鼠成活率最高[12]。

1.2 進行剖宮取胎手術

器材及物品進行消毒與滅菌，通過頸椎脫臼法處死母鼠，充分消毒，按照無菌原則行剖腹產術。為避免污染仔鼠，在切取子宮前結扎兩側輸卵管及宮頸底部，完整分離子宮，避免損傷子宮囊。

1.3 隔離器中剖取仔鼠

將子宮囊充分消毒，轉移至無菌隔離器內。所有物品徹底滅菌并檢測合格后轉入隔離器，進行無菌操作，剪開子宮壁，分離胎盤，剪斷臍帶，取出仔鼠，及時擦拭清理仔鼠口鼻異物，刺激仔鼠促其自主呼吸。

1.4 無菌環境飼養仔鼠

剖得仔鼠后采取人工灌胃哺乳法或者無菌代乳鼠喂養，按無菌操作程序進行樣品接種前制備和接種。在無菌隔離器中給予仔鼠無菌飼料、水、墊料等。

1.5 培育監測無菌鼠群

仔鼠生產和產后接觸的均為無菌環境，但母鼠體內的微生物可能通過胎盤傳播給仔鼠，因此不建議將第一代仔鼠用于無菌實驗。待此無菌新生鼠成年后，在無菌環境內繁殖后代，建立無菌鼠群用于科學研究。飼養仔鼠過程中，每1～2周收集1 次糞便和墊料，監測微生物變化，以實時檢測是否受到污染。

2 抗生素雞尾酒法制作偽無菌鼠模型

給予SPF級大鼠、小鼠抗生素混合物可清除90%腸道微生物，但其體質量形態、生理功能、對全身系統的影響無顯著變化[13-15]。抗生素雞尾酒法只是清除腸道大部分微生物，對口腔、皮膚、呼吸系統等微生物無影響，因此稱為偽無菌動物。通過抗生素雞尾酒法獲得偽無菌鼠模型，是研究腸道菌群與宿主關系、腸道菌群與疾病關系的理想模型。

2.1 選擇抗生素混合物

抗生素的抗菌譜和使用劑量不同，對腸道菌群的作用也不相同。制作偽無菌鼠模型應選擇廣譜抗生素聯合使用，以盡可能最大程度的清除大部分腸道微生物。目前常用的抗生素組合和劑量如下：鏈霉素(100 mg/kg)和新霉素(100 mg/kg)組合[16-21]，鏈霉素(200 mg/kg)、新霉素(200 mg/kg)和桿菌肽(200 mg/kg)[22-24]組合，新霉素(100 mg/kg)、萬古霉素(50 mg/kg)和兩性霉素-B(1 mg/kg)[25]組合，頭孢曲松鈉(350 mg/kg)和慶大霉素(126 mg/kg)[26]組合，氨芐西林(1 g/L)、新霉素(1 g/L)和甲硝唑(0.5 g/L)[27]組合，頭孢羥氨芐(100 mg/kg)、土霉素(300 mg/kg)、紅霉素(300 mg/kg)[28]組合等。

2.2 合理飼養SPF級鼠

以無菌飼料和純凈水飼養SPF級大鼠、小鼠，紫外線每日消毒飼養環境和墊料。注意抗生素混合物給藥途徑和持續時間，一般采用灌胃喂養，每日1次或2次，也可讓大鼠、小鼠自由飲用含抗生素的純凈水。根據實驗要求確定抗生素混合物喂養持續時間，少則3 d[28]，多則2周[25]，一般為5～7 d[1-2,26]。抗生素混合物應每日配制，防止藥效流失，影響造模成功率。

2.3 監測鼠群腸道菌群

抗生素雞尾酒法制作偽無菌鼠模型的方法受到外界環境因素影響較多，因此檢測腸道菌群尤其重要。定期收集新鮮糞便樣本，采用聚合酶鏈式反應(PCR)、熒光定量PCR技術、基因芯片技術或高通量測序等技術[29]實時監測、快速精確的進行腸道菌群檢測，以確定偽無菌鼠是否造模成功。

3 制作方法評價與展望

無菌鼠模型制作技術可以推動微生態學的發展，促進疾病和微生物關系的研究深入發展。由于無菌鼠不攜帶任何生物體，基本排除生物因素對科學研究的干擾，可以明顯提高實驗的敏感性、重復性，有利于探究生命活動基本規律。隨著國內微生物研究的發展，無菌鼠是未來必不可少的動物模型之一。

無菌鼠適用于各種微生物學研究，尤其是研究藥物代謝、微生物寄生蟲、消化系統疾病、腫瘤的理想模型；按照嚴格的制作方法，制備成功率較高；在此基礎上植入某種特定微生物，可以建立悉生動物模型。但實際應用中尚存在以下問題：目前國內具有無菌鼠制備資質的研究所或企業相對較少，制備周期長，制備效率低；無菌鼠制備和飼養成本較高，導致價格昂貴，無法滿足實驗的大量需求；無菌鼠需飼養于無菌隔離器中，要求具備無菌環境，導致供應與應用分離，一定程度限制其推廣，難以充分滿足研究需求。

偽無菌鼠在實驗研究中可以部分代替無菌鼠，廣泛應用于腸道微生物的研究；采用抗生素雞尾酒法制備，制備周期短，制備效率高，價格便宜，制作簡便，對制備和飼養環境要求相對較低，可以滿足實驗的大量需求。但抗生素雞尾酒法制作模型也存在一些問題：目前主要適用于腸道微生物的研究，無法進行皮膚菌群、口腔菌群、泌尿道菌群、生殖道菌群等研究；無法替代無菌鼠模型移植一種或多種菌種建立悉生動物模型；業內尚未形成統一的偽無菌鼠造模成功評價標準；制備成功率相對較低，需進行公認的檢測后才能確定是否造模成功。

在應用方面，根據實際情況不論是采用無菌動物，偽無菌鼠或者悉生動物模型，希望能夠推動制備供應平臺與應用研究平臺分離，促成整體研究應用模型，構建無菌動物規模化高效研究應用體系[30-31]。