動物實驗中兔的不同處死方法的統計分析*

李碩磊 劉繼超 張孟蕾 牛屹東

(北京大學人民醫院 動物實驗室，北京 100044)

隨著人類社會文明的發展，動物福利越來越受到重視，實驗動物“安樂死”也引起了廣泛關注?！鞍矘匪馈?euthanasia)一詞源于希臘文，意思是“幸?！钡乃劳?。我國現有法規標準將“安樂死”稱為“安死術”，科學技術部于2006年發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》中就提出處死實驗動物需要用安死術[1]。安死術是指用公眾認可的、以人道的方法處死動物的技術。其含義是使動物在沒有驚恐和痛苦的狀態下安靜地、無痛苦地死亡[2]。動物實驗中除了最常用到的嚙齒類動物外還會用到大量的兔，通過已有文獻報道可知在實驗動物的使用中，近些年來對嚙齒類動物安樂死現狀已有相關研究分析，而對兔的安樂死現狀卻鮮有報道，本文對知網數據庫中篩選出的文獻進行分析，并對國內外幾種常用的安樂死方法進行了介紹與對比，旨在掌握國內近5年兔處死方法使用情況，以及“安樂死”執行情況，為研究及管理人員提供參考。

1 材料和方法

在知網數據庫中，以“兔”“處死”和“兔”“安樂死”作為檢索詞對國內2017—2021年的文獻進行檢索，并按條件對檢索出的文獻進行篩選，篩選條件為：文獻中開展了兔實驗并將兔處死的文獻。本研究對符合條件的文獻中處死方法的使用情況、處死時是否使用麻醉以及“安樂死”執行情況進行了統計分析，統計分析采用 Excel軟件。

2 結果

2.1 檢索結果

按照方法中描述的檢索方法，以“兔”“處死”和“兔”“安樂死”作為檢索詞，共篩選出368篇文獻，符合研究條件的文獻有367篇，其中有學術期刊174篇，學位論文189篇，特色期刊2篇，會議1篇，圖書1篇。

2.2 處死方法

367篇文獻中有52篇明確提出了兔處死方法，占所有文獻的14.17%(52/367)。涉及空氣栓塞法、頸椎錯位法、過量麻醉法、頸動脈放血法和CO2窒息法等5種方法(表1)。有32篇文獻使用了空氣栓塞法，占61.54%(32/52)。文獻中描述空氣栓塞處死方法的術語有空氣栓塞法、心臟空氣栓塞法、耳緣靜脈空氣栓塞法、耳緣靜脈栓塞法和耳緣靜脈注射空氣法；有12篇文獻使用了過量麻醉法，占23.08%(12/52)。過量麻醉法使用麻醉藥的種類有戊巴比妥鈉，水合氯醛和速眠新，其中使用戊巴比妥鈉的有8篇(劑量為3%戊巴比妥鈉的有7篇，25%戊巴比妥鈉的有1篇)，占15.38%(8/52)，使用水合氯醛的有2篇(劑量為10%水合氯醛的有1篇，沒提到麻醉劑濃度的有1篇)，使用速眠新的有1篇，沒有提到麻醉劑的有1篇；有6篇文獻使用了頸椎脫臼法，占11.54%(6/52)。文中描述頸椎脫臼處死方法的術語有斷頸窒息法、頸椎錯位法和頸椎脫臼法。頸動脈放血法有1篇，占1.92%(1/52)。二氧化碳窒息法有1篇，占1.92%(1/52)。

2.3 符合相關法規、指南、標準推薦的安樂死方法

目前，國內公認的安樂死方法主要參考國科發財字[2006]398號《關于善待實驗動物的指導性意見》、GB/T 39760—2021《實驗動物 安樂死指南》、2020版《美國獸醫協會 動物安樂死指南》。本研究使用空氣栓塞法的文獻有32篇，其中明確符合上述法規、指南、標準推薦的安樂死方法有1篇(非必要不使用該方法，如確實需要需麻醉后進行)在麻醉后進行，占空氣栓塞法的3.22%(1/32)。使用過量麻醉法處死兔的有12篇，其中明確符合上述法規、指南、標準推薦的安樂死方法有9篇(包括8篇注射戊巴比妥鈉和1篇注射速眠新)，占過量麻醉法的75%(9/12)。使用CO2窒息法的文獻有1篇，符合上述法規、指南、標準推薦的安樂死方法。

經統計，在文獻撰寫中明確提及處死方法的52篇文獻，符合上述指南、法規、標準推薦動物安樂死方法的文獻共計11篇，占21.15%(11/52)。

2.4 “安樂死”一詞的使用

在篩選出367篇較明確提出處死方法的文獻，其中僅有23篇文獻提到了“安樂死”一詞，占6.27%(23/367)。

3 討論

動物實驗是生命科學研究中不可或缺的研究方法，實驗中不可避免地會對動物產生傷害[3]。“安樂死”是實驗動物福利的核心之一，實驗者應在掌握了一定的專業技能后，在合適的時機采取恰當的方法對實驗動物實施“安樂死”，最大程度地降低動物的痛苦[4]。本研究結果表明，我國科研人員的實驗動物“安樂死”意識有所欠缺，并且在論文撰寫過程中存在動物處死方法敘述不規范問題，本文就研究中發現的問題進行討論并提出相應建議。

3.1 “安樂死”在論文撰寫、福利倫理審查和發表審核方面被忽視

在本文調查的367篇文獻中，僅有52篇文獻明確提出了兔的處死方法，占14.17%(52/367)；23篇文獻提到了“安樂死”一詞，占6.27%(23/367)；11篇文獻使用了符合相關法規、指南、標準的安樂死方法，占21.15%(11/52)。科研人員應加強相關法律法規的學習，按法規標準、指南要求對實驗動物實施“安樂死”，科研人員所在單位福利倫理審查機構應加強對動物實驗開展前的福利倫理審查和指導，并對實驗開始后課題所涉動物實驗進行監督、核查，學術雜志應加強審核，規范論文在這方面的撰寫，促進動物“安樂死”的實施。

3.2 空氣栓塞法是最常用的處死方法

空氣栓塞法的具體方法是兔耳緣靜脈注射20～40 mL空氣，空氣進入體內靜脈，直至心臟、肺、腦等重要臟器，引起血液循環障礙，使其迅速死亡[5]。在美國獸醫協會( American Veterinary Medical Association，AVMA) 指南中指出空氣栓塞法不作為可接受的首選“安樂死”方法，在使用空氣栓塞法“安樂死”的動物會出現抽搐、角弓反張、鳴叫等臨床癥狀，這很大程度上增加了動物的痛苦，同時也會使實驗者產生較大的心理壓力，如果必須使用該方法“安樂死”動物時，必須先將動物麻醉[6]。本調查中有32篇文獻選用了空氣栓塞處死法，但在麻醉狀態下處死動物的僅有1篇，占使用空氣栓塞法的3.13%(1/32)，表明我國科研人員的“安樂死”意識較為欠缺，或為文中描述不足，也可能涉嫌違反動物福利相關法規和標準?？諝馑ㄈㄒ灿幸欢ǖ膬烖c，與過量麻醉法相比，其不會產生藥物殘留，避免了麻醉藥對組織和器官的傷害，但是空氣栓塞法必須在動物麻醉后進行，如考慮注射藥物對實驗的影響可考慮使用氣體麻醉。

3.3 過量注射麻醉法(靜脈注射戊巴比妥鈉)是AVMA指南中首選推薦的兔安樂死方法

過量麻醉法屬于化學方法，麻醉劑種類有吸入性麻醉劑(異氟醚、氟烷、CO2等)和非吸入性麻醉劑(巴比妥類藥物等)。本調查中使用的非吸入性麻醉劑多為戊巴比妥鈉。巴比妥類藥物(以戊巴比妥鈉為主)是AVMA指南中兔安樂死的首選推薦方法，但根據本調查結果發現該方法僅有15.38%(8/52)的使用比例。此外，使用速眠新麻醉致死的文獻僅有1篇。水合氯醛作為鎮靜藥和抗驚厥藥物而非麻醉藥，現國內外期刊已普遍不再建議使用水合氯醛進行動物麻醉。因此，符合安樂死方法的過量注射麻醉法僅占17.31%(9/52)。非吸入性麻醉法是指通過快速注射過量的麻醉劑，使動物中樞神經過度抑制而死亡，非吸入性麻醉劑有靜脈、腹腔等多種注射方法，優先選擇靜脈注射。靜脈注射大量麻醉劑可以迅速抑制呼吸中樞和心臟跳動，使動物安靜地死去。兔麻醉處死一般采用耳緣靜脈注射麻醉劑，但需要經過一定的專業訓練才能熟練地找到血管并成功注射，并且雛兔血管較細，操作具有一定難度。靜脈注射具有難度時，可以選擇腹腔注射，但腹腔注射需要較大劑量的麻醉劑，而且動物的疼痛和死亡時間都會有所增加[7]，所以可以在麻醉劑中加入局部麻醉藥以緩解腹腔注射帶來的痛苦[8]。

3.4 頸椎脫臼法是較常用的安樂死方法

頸椎脫臼法屬于物理方法，《實驗動物安樂死指南》中指出使用頸椎脫臼法的條件為：(1)其他“安樂死”方法影響實驗結果；(2)頸椎脫臼法可用于體質量低于200 g的嚙齒類動物、禽類，以及體質量低于1 kg的兔。除非有特殊需求，實施頸椎脫臼前應當先給予動物鎮定劑或吸入CO2，以減輕動物的痛苦；(3)操作人員應接受完整的技術訓練，并以尸體多次練習后方可正式實施[9]。對于體質量大于1 kg的兔，即使是技術熟練的操作者也不能保證將兔頸椎完全脫臼，這時可以借助固定動物頭部的特殊裝置，通過拖拽后肢來完成頸椎脫臼[10]。本調查中有6篇論文使用了頸椎脫臼法處死動物，但沒有1篇是在麻醉狀態下實施的，且根據實驗方案可知，實驗中涉及的兔的體質量均超過1 kg。可以看出目前我國科研人員在涉及兔的實驗中“安樂死”意識極為欠缺，并且可能存在操作嚴重不規范問題。

4 總結

隨著人們認知的進步，實驗人員在從事生命科學研究時越來越重視動物福利。動物福利是社會進步和經濟發展到一定階段的必然產物，體現了人與動物協調發展的趨勢[5]。從動物種類、動物痛苦程度、實驗需求和成功率方面考慮，結合實際情況，選擇合適的安死術可以有效減輕動物臨終前痛苦[11]，確保動物的臨終福利得到保障。我國已經出臺了《關于善待實驗動物的指導性意見》、國家標準《實驗動物安樂死指南》等與實驗動物“安樂死”相關的法規和標準，但這僅是第一步，還需加強相應技術的培訓與考核，加強福利倫理委員會的審查與監督，嚴格期刊雜志的投稿審核，提高科研實驗人員動物福利的意識，熟練掌握安樂死方法，將動物福利落實到實處，落實在動物“安樂死”方法這一動物福利的核心點上，確保動物實驗能夠合規、合法完成，確保實驗數據能夠科學有效獲得。