實驗動物質控能力驗證中酯酶-1和轉鐵蛋白檢測能力評價*

王 洪 魏 杰 光姣娜 周佳琪 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

能力驗證的定義是利用實驗室間比對，按照預先制定的準則評價參加者的能力[1]。能力驗證是實驗室外部質量控制的重要組成部分。能力驗證計劃的組織實施有助于了解實驗室能力，識別實驗室間的差異，提高實驗室技術水平，為服務客戶提升信心。同時有助于識別實驗室管理體系和技術能力可能存在的問題和風險。能力驗證是實驗室能力評價的重要手段。實驗室參加能力驗證活動一次滿意或不滿意，存在一定偶然性，但某個項目多次不滿意或一個單位參加多個項目同時不滿意，則表明其技術能力存在問題，質量管理體系存在風險。本實驗室自2013年起，連續(xù)8年組織實施符合國際質量管理體系認可的實驗動物質量控制領域相關的能力驗證計劃。

實驗動物在生物制品質量控制領域和藥物安全性評價領域應用廣泛，實驗動物與實驗試劑、實驗儀器一樣直接影響科學研究的實驗結果。實驗動物質量的標準化直接決定生物醫(yī)藥研究產出實驗數(shù)據的準確性和可重復性。實驗動物的質量控制歸根究底是對動物實驗產出數(shù)據的質量控制。實驗動物的標準化包括遺傳質量控制和微生物質量控制，而實驗動物的遺傳質量是所有動物實驗開展的前提和基礎，遺傳質量不合格的實驗動物必然無法保證實驗數(shù)據的準確性和可重復性。本次能力驗證計劃中的檢測項目酯酶-1和轉鐵蛋白屬于實驗動物遺傳質量控制領域的檢測項目，該能力驗證計劃主要用于考察實驗室在實驗動物遺傳質量控制方面的檢測水平。

本次能力驗證NIFDC-PT-202計劃的組織實施旨在考察實驗室在酯酶-1和轉鐵蛋白這兩個項目的檢測能力，幫助實驗動物質量控制實驗室發(fā)現(xiàn)問題，同時促進我國實驗動物質量控制水平的提升。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：8周齡，雌性，近交系小鼠CBA,20只；8周齡，雌性，近交系小鼠 C57BL/6 20只，均來源于北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物生產許可證編號SCXK(京)2014-0004，實驗動物使用許可證編號SYXK(京)2017-0013。動物福利倫理審批號【中檢動(福)第2019(A)001號】。按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.1.2儀器設備：離心機【品牌：Thermo，型號：X1R，購自賽默飛十世爾科技(中國)有限公司】；真空冷凍干燥機(品牌：LABCONCO，型號：FREEZONE4.5，LABCONCO公司)。

1.2 方法

1.2.1檢測樣品：本次能力驗證計劃提供的被測樣品為實驗小鼠血清凍干粉。制備方法按照國家標準GB/T14927.1—2008 準備抗凝真空采血管BD vacutainer，K2 EDTA抗凝，采集血液樣本，離心3 000 r/min 10 min，分離血漿。加入保護劑，分裝，每瓶裝量為50 μL血漿，用凍干機凍干，加蓋。實驗小鼠血漿凍干粉為淡粉色固體。對樣品進行隨機編號，-30 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ總€參加單位將獲得樣品5份，通過泡沫箱加干冰和冰袋的方式運輸。樣本經過均勻性和穩(wěn)定性檢驗，滿足質量控制的要求[2]。

1.2.2參加單位：本次能力驗證計劃面向全國實驗動物質量檢驗機構，全國藥品質量檢定系統(tǒng)，以及相關企業(yè)高校研究所的實驗室。報名參加本次能力驗證計劃NIFDC-PT-202的單位共計9家，所有實驗室全部提交了檢測結果。9家實驗室包括7家省級實驗動物質檢機構和2家研究所實驗室。

1.2.3能力驗證項目：本次計劃要求進行實驗小鼠血清中酯酶-1和轉鐵蛋白檢測，檢測指標包括酯酶-1 a基因型、酯酶-1 b基因型、轉鐵蛋白a基因型和轉鐵蛋白b 基因型。

1.2.4實驗方法：本次能力驗證計劃推薦依據國家標準GB/T14927.1—2008進行檢測。為保證檢測結果具有可比性，能力驗證樣品無需加工處理，加入50 μL蒸餾水溶解后即可進行檢測。檢測結果為定性的結果，報告基因型a型或b型。檢測結果填寫在能力驗證網絡平臺。紙質版原始記錄通過郵寄發(fā)送到能力驗證計劃組織方。

1.2.5評價方法：本次能力驗證計劃的結果是定性結果，將各實驗室上報的檢測結果與標準結果進行比較，實驗室提供的結果與標準結果一致時，判定為滿意；實驗室提供的結果與標準結果不一致時，判定為不滿意；如果實驗室未按作業(yè)指導書要求的時限提交檢測結果，判定為不滿意。

2 結果

收集整理參加實驗室反饋的原始記錄，本次能力驗證計劃的參加實驗室均采用國家標準GB/T 14927.1—2008中推薦的生化標記檢測法。本次計劃共發(fā)出樣本9份，每份5支，9家實驗室全部提交檢測結果。獲滿意結果的實驗室有7家，2家實驗室獲得不滿意結果(實驗室代碼138和287)。該計劃的滿意率為77.78%。

2.1 樣品檢測前運輸和存放

實驗室收到樣本的快遞時間1～3 d，收到樣品后實驗室存放樣品至檢測的時間1～11 d。詳見表1。

表1 各實驗室樣品快遞時間和樣品檢測前的保存時間明細表Table 1 Sample delivery time and storage time before testing in each laboratory

2.2 實驗室醋酸纖維素膜的選擇

實驗室分別選擇國產軟膜(1家，實驗室代碼092)、國產硬膜(7家)和進口硬膜(1家，實驗室代碼181)進行檢測(圖1～3)。

圖1 國產軟膜( 092實驗室)Fig.1 Domestic soft membrane (092 laboratory)

圖2 國產硬膜Fig.2 Domestic hard membrane

圖3 進口硬膜(181實驗室)Fig.3 Import hard membrane (181 laboratory)

2.3 檢測方法及檢測點樣位置

在轉鐵蛋白這個檢測項目上，有1家實驗室(實驗室代碼181)選擇非標方法-氨基黑染色法進行檢測。其他8家實驗室均選擇國家標準中推薦的麗春紅染色法(圖4～5)。

圖4 國家標準方法(麗春紅法)Fig.4 National standard (Method Ponceau)

圖5 非國家標準方法(氨基黑方法，181實驗室)Fig.5 Non-standard method (amino black, 181 laboratory)

實驗室(實驗室代碼118和092)變換點樣的位置，重復多次進行檢測，保證檢測結果的準確性(圖6～7)。

圖6 778實驗室Fig.6 778 laboratory

圖7 092實驗室Fig.7 092 laboratory

2.4 電泳的邊緣效應

由于電泳的邊緣效應導致邊緣加樣孔樣本的泳動距離發(fā)生偏離(圖8)。

琢句之法，唯少陵獨盡其妙。……及至蘇、黃，則使事亦精，逸氣橫出，琢句之妙可以與少陵并駕。……詩家作詩多使事，謂之點鬼簿。……近者蘇、黃崛起，雖追尚其法，而造語益工，了無斧鑿之痕，可謂青于藍矣。……山谷云“語言少味無阿堵，水雪相看只此君”，“眼看人情如格五，心知世事等朝三”，類多如此。[10](8冊，P11-36)

圖8 邊緣效應(138實驗室)Fig.8 Edge effect (138 Laboratory)

3 討論

3.1 影響本次能力驗證結果的關鍵因素

建議實驗室著重從以下5個方面分析能力驗證結果，有助于實驗室找到不滿意結果的原因。

3.1.1樣品的保存條件：樣品的穩(wěn)定性研究表明，本次能力驗證計劃的樣本應保存于-20 ℃，而且不宜長期保存。實驗室應根據自身條件及時安排實驗。應保證樣品的保存條件不影響樣品的穩(wěn)定性，以保證檢測結果的穩(wěn)定和能力驗證結果的準確。

3.1.2醋酸纖維素膜的選擇：9家參加本次能力驗證的實驗室使用了3種規(guī)格的醋酸纖維素膜：進口硬膜60 mm×76 mm，國產硬膜70 mm×90 mm，國產軟膜70 mm×90 mm。3種膜規(guī)格不同，涂層厚度不同，涂層的顆粒大小不同，電泳條帶形狀不同，電泳條帶清晰度不同。實驗室需考慮到不同規(guī)格的醋酸纖維素膜對實驗結果的影響。

3.1.3染色方法的選擇：國家標準染色方法：0.5% Ponceau S 溶解于 5% 三氯乙酸，1%冰醋酸。非標染色方法：氨基黑0.01 g，甲醇40 mL，冰醋酸10 mL，蒸餾水50 mL。脫色：甲醇40 mL，冰醋酸10 mL，蒸餾水50 mL。非標方法的條帶顏色與背景色差明顯，結果易于讀取。

3.1.4重復性驗證的重要性：能力驗證樣品的構成通常模擬實際工作中的復雜情況，配置多種類型的樣本。實驗室有必要進行重復，保證檢測結果的準確性。而且建議調整樣本的點樣順序，避免不同位置導致的偏差，保證能力驗證結果的可靠性。

3.1.5點樣位置對檢測結果的影響：理想的平板電容器的電場線是直線的，但在實際情況下，靠近邊緣的地方電場線會變彎，越靠近邊緣就彎的越嚴重(電泳的邊緣效應)。因此，造成靠近邊緣加樣孔的檢測結果出現(xiàn)偏差。避免邊緣效應的方法，其一，在有剩余加樣孔的情況下，重復點樣；其二，變換點樣位置，多張醋酸纖維素膜進行檢測。

3.2 能力驗證計劃實施流程[3-19]

方案設計：本次能力驗證計劃的位點選擇實驗小鼠遺傳質量檢測生化標記檢測法中血清樣本的全部兩個位點酯酶-1和轉鐵蛋白，每個實驗室發(fā)放樣本數(shù)量為5支，為歷年來樣本數(shù)最多的一次。同一個計劃考察兩個項目，每個實驗室收到5個樣本，都增加了本次能力驗證活動的難度。

均勻性檢驗和穩(wěn)定性檢驗：本次能力驗證計劃的樣本通過均勻性檢驗后進行保藏穩(wěn)定性(短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性)、運輸穩(wěn)定性和最終的穩(wěn)定性驗證。

能力驗證計劃的實施還包括發(fā)放樣品，反饋結果和匯總報告。

3.3 能力驗證結果的利用和糾正措施的選擇[20-21]

對于參加能力驗證計劃，獲得不滿意結果的實驗室，實驗室應核查實驗室的人員、儀器設備、試劑、操作方法，依據標準、環(huán)境因素等方面，找到不滿意結果的原因。實驗室可以在180 d內參加該項目的測量審核活動，對不滿意結果進行糾正。測量審核是“一對一的能力驗證”。

只有在能力驗證活動中表現(xiàn)滿意，或對于不滿意結果能證明已開展了有效糾正措施的實驗室，CNAS方受理認可申請或予以認可。對參加能力驗證活動，且有穩(wěn)定滿意表現(xiàn)的實驗室，在CNAS的各類評審中可考慮適當簡化相關項目的能力確認過程。實驗室應保存上述記錄以備評審組檢查。當不滿意結果已不能符合專業(yè)標準或規(guī)范時，除實施糾正措施并驗證其有效性外，實驗室還應自行暫停在相應項目的證書/報告中使用CNAS 認可標識。在驗證糾正措施有效后，實驗室可自行恢復使用認可標識。對不能滿足能力驗證領域和頻次要求，或雖參加了能力驗證但結果不滿意且未在180 d內開展糾正措施及其驗證活動的實驗室，CNAS 可撤銷其相應項目的認可資格。

通過組織實施本次能力驗證計劃NIFDC-PT-202 實驗小鼠血清中酯酶-1和轉鐵蛋白檢測，作者發(fā)現(xiàn)實驗動物質量控制實驗室在酯酶-1和轉鐵蛋白的整體檢測水平較高，少數(shù)實驗室存在提升空間。本研究中對實驗室在酯酶-1和轉鐵蛋白檢測能力評價的結果，能夠促進我國實驗動物質量檢測水平的提升。