弓形蟲RH株感染比格犬動物模型的建立*

問婉欣 陳洪巖 韓凌霞

(中國農業科學院 哈爾濱獸醫研究所實驗動物與比較醫學團隊 獸醫生物技術國家重點實驗室黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室 國家禽類實驗動物資源庫，哈爾濱 150069)

弓形蟲病是由剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii,T.gondii)引起的一種人獸共患寄生蟲病，呈世界性分布，在哺乳動物、鳥類、貝類、魚類等多種動物體內發現，可在有核細胞內寄生，對宿主造成全身性損傷。弓形蟲病感染模型是防治弓形蟲病的重要條件，已報道的弓形蟲病感染模型，包括小鼠[1-13]、大鼠[14-16]、豬[17-19]、山羊[20-21]、雞[22]、貓[23]和犬[24]等。除嚙齒類外，其他感染用動物都不是標準的實驗動物，因此得到的臨床表現和實驗結果不盡相同，不利于弓形蟲病的進一步研究。

犬由于特殊的舔舐行為，容易接觸含有弓形蟲卵囊的土壤，是重要的自然感染宿主，隨著寵物犬的數量越來越大，建立犬弓形蟲發病模型對研究和防治犬弓形蟲病的意義愈加明顯[25]。本研究采用經過生物學凈化的實驗用比格犬，在負壓II級動物生物安全等級實驗室進行了弓形蟲感染實驗，以期建立弓形蟲感染犬的發病模型。

1 材料和方法

1.1 材料

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)RH株由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所賈洪林研究員提供，利用Vero E6細胞系增殖和保存。無特定病原體(specific pathogen-free, SPF)級76日齡雄性比格犬5只，由青島博隆實驗動物有限公司提供，生產許可證號SCXK(魯)2017-0006。犬弓形蟲特異性血清抗體陰性【利用中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供的弓形蟲間接血凝試驗(IHA)試劑進行檢測】。感染實驗在青島澳蘭百特生物科技有限公司【SYXK(魯)2017-0013】的動物生物安全等級II級實驗室進行。本實驗經過該單位的實驗動物使用福利倫理審查，倫理審批號：OLBT20191201，實驗結束后的動物殘體經無害化處理。Premix Ex Taq(Probe qPCR)、pMD18-T(TaKaRa公司)；FastPure GeL Extraction MiniKit(Vazyme公司)；EndoFree Maxi Plasmid Kit、血液/組織/細胞基因組DNA提取試劑盒【天根生化科技(北京)有限公司】。

1.2 方法

1.2.1弓形蟲感染犬實驗：將5只76日齡SPF級比格犬分為2組：實驗組3只，編號分別為9190#、9192#、9196#，接種弓形蟲時體質量分別為1.5 、1.5和0.95 kg；對照組2只，編號分別為9093#和9098#。在負壓屏障環境下分別飼養于兩個房間，采用離地式畜欄飼養，飼料來自青島博隆實驗動物有限公司。實驗組每只腹腔注射1.5×107個弓形蟲速殖子，對照組接種等體積的滅菌PBS。接種后每日8時和14時利用獸用電子測溫計測量直腸溫度各1次，采集咽拭子和肛拭子各1次，用于檢測弓形蟲的B1基因。8 d后結束實驗，稱量體質量，前肢肌肉注射舒泰?50深度麻醉所有犬，經瞳孔觀察和肌肉反射檢查，確認動物死亡后，剖檢，采集部分肝、脾、肺、肺門淋巴結、腸系膜淋巴結、腹水、腎和大腦等組織，置于-20 ℃保存，用于提取基因組DNA進行弓形蟲核酸定量檢測；另取部分組織立即置于甲醛溶液，用于制備石蠟切片，進行蘇木精-伊紅(HE)染色。以弓形蟲抗豬高免血清為一抗(中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供)，HRP標記抗豬IgG為二抗，對感染犬的肝組織石蠟切片進行免疫組織化學檢測。

1.2.2犬咽拭子和肛拭子中弓形蟲B1基因的PCR檢測：利用天根血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，按照產品使用說明書，提取實驗犬咽拭子和肛拭子中的基因組DNA。根據參考文獻[26]合成弓形蟲B1基因特異性引物，引物序列為：TPG1∶5′-TGTTCTGTCCTATCGCAACG-3′，TPG2：5′-ACGG ATGCAGTTCCTTTCTG-3′。擴增產物大小為580 bp。PCR反應體系為：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 10 μL、TPG1 和TPG2 各1 μL(10 μmoL/L)、模板1 μL、ddH2O 7 μL。反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環，最后72 ℃ 延伸5 min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠進行核酸電泳，電泳結果在凝膠成像系統(SmartGelTMImage Analysis System)記錄并保存。

1.2.3犬不同組織中弓形蟲Rep 529 nt定量PCR 檢測：根據弓形蟲Rep 529 nt 重復片段建立熒光標記實時定量PCR方法[27]。引物Rep529F序列為：5′-GTTGGGAAGCGACGAGAGTC-3′，Rep529R：5′-ATTCTCTCCGCCATCACCAC-3′，探針序列為 5′-FAMAGAAGATGTTTCCGGCTTGGCTGCTTTAMRA-3′。先擴增Rep529 nt，構建重組質粒，反應體系為：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 25 μL、Rep529F和Rep529R各2.5 μL(10 μmoL/L) 、模板5 μL、ddH2O 15 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環，最后72 ℃ 延伸5 min。常規方法克隆至pMD18-T載體，構建重組質粒，經吉林省庫美生物技術有限公司測序鑒定。將質粒利用紫外分光光度計測定濃度，連續10倍稀釋，每個稀釋度3次重復，繪制熒光定量PCR反應標準曲線。定量PCR反應體系為Premix Ex Taq 10 μL、Rep529F 和Rep529R各0.4 μL(10 μmoL/L) 、探針 0.8 μL、模板 2 μL、去離子水 6.4 μL。定量PCR反應程序為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。使用QuantStudio 5熒光定量PCR儀對結果進行分析，繪制標準曲線。根據產品使用說明書，提取犬不同組織中的基因組DNA，測定濃度和純度后，檢測弓形蟲Rep529 nt重復片段的拷貝數。每個被檢樣品設3個重復。

2 結果

2.1 犬感染弓形蟲后的臨床癥狀

攻毒犬和對照犬的食欲和精神狀態均無明顯異常。實驗犬感染弓形蟲后第3天，犬9192#和9196#的眼角出現少量分泌物；4 dpi至6 dpi時，9190#的鼻鏡表觀發干；隨著病程延長，逐漸出現腹瀉，6 dpi時全部為稀便。攻毒犬8 d的平均體溫、最低溫度和最高溫度均高于對照犬，在4 dpi或5 dpi達到39.0 ℃，攻毒時體溫(0 dpi)及攻毒后的體溫變化見圖1。

圖1 犬接種弓形蟲后的體溫變化Fig.1 Body temperature curves ofT. gondii-infected dogs

2.2 拭子中弓形蟲B1基因的PCR檢測

對咽拭子和肛拭子中的弓形蟲核酸進行檢測，結果表明，攻毒犬在1 dpi即能從犬9192#的肛拭子中擴增出陽性條帶，接著從咽拭子和肛拭子中擴增條帶，最后的陽性檢出樣品是6 dpi犬9192#的肛拭子。所有的樣品中肛拭子的陽性率高于咽拭子，3 dpi時陽性樣品的數量最多，對照犬PCR結果陰性，見表1。

表1 感染犬的口腔拭子和肛拭子中弓形蟲核酸的PCR檢測結果Table 1 PCR results in the oral and anal samples of T.Gondii-infected dogs

2.3 大體病變及病理組織學檢測結果

接種8 d后，感染犬體溫正常，無明顯臨床癥狀，結束實驗。剖檢發現，3只攻毒犬均產生不同程度的腹水，清亮無異味或呈棕色(圖2A)。組織學檢測結果表明，感染犬的肝(圖2B)細胞大量變性壞死，伴有局灶性炎性細胞浸潤；腎小管(圖2C)上皮細胞部分變性，少量壞死；扁桃體、腸系膜淋巴結均出現巨噬細胞輕度增生，脾出現局灶性含鐵血紅素沉積，胰腺有少量腺泡細胞變性，嗜堿性增強。卵巢、盲腸、十二指腸、回腸和直腸無明顯異常。對照犬未見異常。以弓形蟲抗豬高免血清為一抗，對9196#犬的肝臟進行免疫組化檢測，未見明顯特異性顯色(圖2D)。

注：A：感染犬腹腔腹水；B：感染犬肝；C：感染犬腎； D：感染犬肝的弓形蟲特異性免疫組化Note：A: ascite in infected caine; B: infected liver; C: infected kidney; D:IHC result of infected liver圖2 犬感染弓形蟲后的大體病變和病理組織學變化Fig.2 Gross changes and histopathological observations of T.Gondii-infected dogs

2.4 不同組織中弓形蟲核酸拷貝數的定量檢測

構建成功重組質粒pMD-Rep529。以質粒的拷貝數為橫坐標，以Ct值為縱坐標，繪制曲線，獲得標準曲線方程：y=-4.642x+54.498，相關系數(r2)為0.995。感染8 d后對犬安樂死，對犬的主要組織臟器中含有的弓形蟲核酸拷貝數進行定量比較，結果表明弓形蟲主要存在于腸系膜淋巴結、肝和盲腸，見圖3。

圖3 感染犬不同組織中弓形蟲核酸拷貝數Fig.3 Nucleotide copies of T. gondii in various tissues of the infected dogs

3 討論

弓形蟲為胞內寄生蟲，對寄生的細胞類型沒有選擇性，臨床癥狀因受感染的細胞不同而出現不同的反應。健康成年動物表現為亞臨床，幼年動物因多種組織器官的炎性反應表現出發熱、咳嗽、呼吸困難、腹瀉、黃疸、癲癇甚至死亡。自然感染途徑為消化道感染成熟卵囊致病，但只有在貓體內才能形成裂殖體、配資體和卵囊的形態，因此弓形蟲感染模型較難完全復制出自然感染癥狀。

實驗用比格犬來自人工哺乳、隔離器內喂養生長，生物進化的比格犬，其親代在人流、物流和氣流環境受到嚴格控制，按照GB 14922.2—2011《實驗動物微生物等級及監測》的規定免疫了狂犬病、犬瘟熱、犬細小病毒和犬傳染性肝炎疫苗，在遺傳背景、攜帶病原體、飼料營養等方面的個體差異較小。感染實驗設施為屏障環境。采用腹腔接種體外培養的速殖子的方式，以盡量準確計數速殖子數量，但因此有可能降低了對犬的致病性。

感染犬出現一過性發熱，在4 d左右體溫升高至39 ℃，持續1～2 d恢復至正常。有報道[24]4只腹腔接種104個RH株速殖子犬的體溫在7至14 d后略有升高，只有1只犬出現食欲減退、腹瀉和呼吸急促，55 d后死亡，另3只犬直到62 d僅出現中度癥狀。與本實驗結果相似。利用肉雞人工腹腔接種1×108、1×107或1×106個JS株速殖子后2 d，直腸溫度也短時升高[22]。嚙齒類動物感染模型的報道未提供體溫數據，或許與發熱時間短不易觀察有關。結果表明單因子弓形蟲感染，會短時溫和升高動物體溫。

輕度短時腹瀉是弓形蟲感染的另一個癥狀。本實驗中比格犬在接種后先后出現腹瀉，6 d時觀察到的糞便全部為稀便(每日兩次清除糞便)，之后稀便的比例逐漸減少，至8 d時恢復正常。與組織病理學檢測結果犬的十二指腸、回腸、盲腸和直腸未見明顯異常相符合。但大鼠口服5 000個ME-49株卵囊后觀察到腸黏膜下層和肌層萎縮，腸細胞高度降低，杯狀細胞增多，十二指腸的變化與感染時間成正比[15]。

本研究中3只感染犬均出現少量腹水，呈暗紅色或透明無色，清亮不渾濁。組織學檢測結果，肝細胞出現大量變性壞死，伴局灶性壞死，炎性細胞浸潤，與已報道的弓形蟲感染結果一致，例如門靜脈和中央靜脈周圍淋巴細胞浸潤[16]，局灶性充血、變性和壞死[28]，肝竇增大[22]，在個別細胞中抗原呈陽性[28]。但沒有觀察到明確的由宿主細胞膜包繞而成的假包囊，也未見明顯的蟲體自身分泌物形成的包囊，可能與感染后時間較短(8 d)，或者宿主(SPF級幼犬)相對于體外滋養體的抵抗能力較強有關。肺臟也易引起病變[16,22,28]，本研究中感染犬的扁桃體僅出現輕微增生。定量PCR檢測結果標明，弓形蟲在宿主體內的分布沒有明顯的組織特異性。

制備疫病感染模型標準的關鍵是標準化病原體和宿主。中等毒力弓形蟲毒株常造成隱性感染，RH株是代表性強毒株。利用SPF級比格犬腹腔接種弓形蟲RH株，主要引起一過性體溫升高和明顯的短時腹瀉，導致肝組織變性和壞死，對腸道無明顯損傷，糞便相比于口腔是更重要的排蟲方式。

弓形蟲基因型眾多，人犬共感染情況不容忽視，建立弓形蟲感染犬發病模型對防治犬弓形蟲病具有一定的提示作用。