甘丙肽受體2基因敲除小鼠的飼養(yǎng)繁育及基因型鑒定*

馬燕華 何 旎 裴少非 呂 典 李文君 樊保敏 曾廣智 林成源

(云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點實驗室，昆明 650500)

甘丙肽受體2(Galanin receptor 2, GalR2)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的各個器官組織，是神經(jīng)肽甘丙肽(Galanin)和Spexin的共同受體之一。Galanin和Spexin是同屬于Gal/Kiss肽家族的小分子神經(jīng)肽，是機體內(nèi)調(diào)控多種生理變化和疾病發(fā)展的重要激素，兩者均能夠通過G蛋白偶聯(lián)受體GalR2介導(dǎo)多種重要的生理病理調(diào)節(jié)作用，如肥胖癥[1]、2型糖尿病[2]、阿爾茨海默病[3]、抑郁癥[3-4]、炎癥性疼痛[5]、胃腸道功能調(diào)節(jié)[6]等。這些疾病的發(fā)病原因十分復(fù)雜，GalR2在這些疾病發(fā)生的病理過程中發(fā)揮的影響機制尚未清楚，因此，對于GalR2基因編碼的蛋白受體在人類健康和疾病治療中的影響機制亟待探索。隨著基因編輯技術(shù)的完善度與精確性的不斷提高，第三代基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9應(yīng)運而生。GalR2基因敲除模型可以從整體水平上研究該偶聯(lián)蛋白受體在機體內(nèi)的功能，因此，本文針對引進的小鼠的飼養(yǎng)繁育與基因型鑒定，篩選出GalR2基因敲除小鼠，對其生長發(fā)育和相關(guān)的疾病研究具有重要作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

GalR2基因敲除小鼠通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)制備而得，由賽業(yè)模式生物研究中心(太倉)有限公司引進，2雄3雌，遺傳背景為C57BL/6N小鼠，基因型均為雜合子(GalR2+/-)。

1.2 主要試劑與儀器

蛋白酶K(產(chǎn)品編號：3022765，Merck公司)；瓊脂糖Agarose G-10(產(chǎn)品編號：162135，Biowest公司)；GelRed核酸染料(產(chǎn)品編號：41003，Biotium公司)；Premix Taq (產(chǎn)品編號：RR901A，TaKaRa公司)；GeneRuler DNA Ladder(產(chǎn)品編號：00593738，Thermo Scientific公司)；DNA上樣緩沖液(產(chǎn)品編號：6601783，Biosharp公司)。

MAST-A型脈動真空滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；5424R型離心機(Eppendorf公司)；THZ-100B型恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DRY BLOCK HEATER金屬浴(IKA集團)；FlexCycler2多功能PCR儀(耶拿分析儀器股份公司)；JY600型電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；SC805型全自動凝膠成像系統(tǒng)(蘇州百拓生物技術(shù)服務(wù)有限公司);SPF小鼠維持飼料和SPF玉米芯墊料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司)。

1.3 小鼠的飼養(yǎng)和繁殖

所有繁育的小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物設(shè)施中，實驗動物使用許可證號SYXK(滇)K2017-0001。室內(nèi)溫度控制在22～26 ℃，濕度50%～60%，光照明暗控制各為12 h，小鼠籠盒、玉米芯墊料以及飲用水均經(jīng)過高溫、高壓滅菌處理。飼養(yǎng)過程中，每天進入動物設(shè)施1次，添加飼料和水并觀察小鼠的生長情況，玉米芯墊料每周更換1次，體質(zhì)量每兩周記錄1次。

小鼠的繁殖方式為將性成熟的小鼠(6～8周齡)以雄雌1∶2的比例于IVC籠同籠合養(yǎng)。繁殖方法為雜合子×雜合子，野生型×雜合子。雌鼠的妊娠期為12～25 d。

1.4 小鼠的基因型鑒定

因引進的GalR2基因敲除小鼠基因型為雜合子，根據(jù)孟德爾經(jīng)典遺傳學(xué)，繁育獲得的子代，其基因型可能為純合子(GalR2-/-, Homozygotes, Ho)、雜合子(GalR2+/-, Heterozygotes, He)及野生型(GalR2+/+, Wild-type, WT)。

1.4.1小鼠組織DNA的提取：將小鼠固定，剪取2～5 mm鼠尾，置于離心管中并加入100 μL尾消化緩沖液和1 μL蛋白酶K(終濃度0.5 mg/mL)，置于56 ℃，190 r/min搖床過夜；次日將其置于98 ℃金屬浴13 min使蛋白酶K變性，并于25 ℃，14 000 r/min離心15 min，取上清液，獲得粗提DNA，于-20 ℃保存。

1.4.2聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)：PCR反應(yīng)引物由擎科生物技術(shù)有限公司昆明合成部合成，引物序列見表1。PCR擴增體系為25 μL，即在普通PCR八連排管中分別加入 9.0 μL ddH2O、1.0 μL Product Primer F、1.0 μL Product Primer R、12.5 μL Premix Taq和1.5 μL 小鼠鼠尾DNA。以94 ℃預(yù)變性3 min、 94 ℃變性30 s、60 ℃退火35 s、72 ℃延伸35 s，循環(huán)35次，再以72 ℃進行2次延伸5 min為PCR擴增條件對小鼠GalR2基因進行擴增。

表1 PCR擴增引物序列Table 1 Sequences of the primers used for PCR analyses

1.4.3瓊脂糖凝膠電泳及基因型鑒定：使用GelRed預(yù)制膠法配制0.5%瓊脂糖凝膠，取PCR產(chǎn)物5 μL和Marker 1 μL于加樣孔中進行電泳分析，加樣完畢后，設(shè)定電壓為120 V，電泳時間為30 min，肉眼可見溴酚藍泳至距制膠板前端2～3 cm處即可停止電泳。切斷電源，取出凝膠，用全自動凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照保存。

由引物F1和R1擴增而得的DNA條帶位于416 bp，為純合子小鼠Ho；由引物F2和R1擴增而得的DNA產(chǎn)物條帶位于609 bp，為野生型小鼠WT；兩個DNA產(chǎn)物條帶均存在，為雜合子小鼠He。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠繁殖及生長情況

從蘇州引進的種鼠成功繁育子代，每只母鼠孕期20～23 d，哺乳期18～25 d，產(chǎn)仔數(shù)6～12只，成活率大于96%。目前已穩(wěn)定繁殖至F3代，具體的繁殖情況如表2所示。有小部分小鼠在出生3～6周時其后背部會出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象(并非由于同伴互相舔舐造成的脫毛)，但未出現(xiàn)其他異常情況。如若一窩幼鼠為10～12只時，會出現(xiàn)1～2只幼鼠因無法獲得哺乳而體型過小致死，同時，讓其他母鼠代乳會出現(xiàn)食子現(xiàn)象。

表2 F1-F3代小鼠繁殖情況(只)Table 2 Reproduction of F1-F3 generation mice(n)

2.2 小鼠基因型鑒定結(jié)果

對引進的5只小鼠進行基因型檢測。電泳條帶位于416 bp和609 bp有較亮的熒光為雜合子He，電泳條帶位于609 bp為野生型WT(圖1)，與該公司提供的鑒定報告一致。

圖1 引進的GalR2基因敲除小鼠基因型鑒定Fig.1 Identification of imported GalR2 gene knockout mice

對繁殖獲得的小鼠進行基因型檢測。DNA條帶位于416 bp處為純合子Ho，電泳條帶位于416 bp和609 bp為雜合子He，電泳條帶位于609 bp為野生型WT。在100 bp中比較亮的條帶是樣品中出現(xiàn)引物二聚體引起的(圖2)。

圖2 子代GalR2基因敲除小鼠基因型鑒定Fig.2 Identification of GalR2 gene knockout in offspring mice

2.3 基因敲除小鼠繁育結(jié)果

將引進的GalR2基因敲除雜合子雄鼠和野生型雌鼠以1∶2的比例，或雜合子雌鼠和野生型雄鼠以2∶1的比例進行交配繁殖，獲得的F1代雜合子小鼠進行同胞交配，獲得F2代純合子、雜合子和野生型小鼠。F2代子代之間進行同籠交配繁殖獲得F3代，繁殖方式同F(xiàn)1代(圖3)。

圖3 GalR2基因敲除小鼠基因型繁殖策略Fig.3 Strategy of breeding of GalR2 gene knockout mice

2.4 小鼠體質(zhì)量變化

經(jīng)觀察(圖4)，三種基因型的雌鼠體型從離乳開始就可以明顯看到差異，明顯小于同周齡雄鼠，并隨著年齡的增長逐漸拉開差距，與鑒定IG結(jié)果一致。

注：A. 雄鼠; B. 雌鼠Note：A. Male mice; B. Female mice圖4 GalR2基因敲除小鼠體質(zhì)量變化趨勢圖Fig.4 Body weight of GalR2 gene knockout mice

3 討論

基因敲除小鼠是一種利用新型的分子生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合細胞生物學(xué)和動物胚胎學(xué)的方法，使小鼠體內(nèi)特定的基因失活或功能缺失的模型，以系統(tǒng)了解哺乳動物的生理和生化過程，并以此生成“人源化”小鼠模型作為新藥開發(fā)策略的一部分[7]。GalR2是神經(jīng)肽Galanin和Spexin的共同受體，其表達水平的改變與兩類神經(jīng)肽的表型重塑和疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來，已有研究者利用反轉(zhuǎn)錄病毒誘變方法建立了該模型小鼠并進行了相關(guān)的行為學(xué)和體內(nèi)激素分泌研究，對GalR2在人類相關(guān)疾病過程的作用和機制研究有了進一步的認識[8-11]。但與之不同的一點是，本研究中使用了新近發(fā)展起來的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，此技術(shù)在哺乳動物中可實現(xiàn)快速準確定位待編輯的基因，具有簡單高效、廉價易用等特點[12]。此外，該項技術(shù)已成功運用在神經(jīng)退行性疾病和遺傳性疾病的相關(guān)動物模型中[13]，為探索相關(guān)疾病的治療方法具有重要意義，也為研究GalR2在阿爾茨海默病、抑郁癥和2型糖尿病等復(fù)雜疾病中的作用機制提供了可靠的研究手段。

本次引進的GalR2基因敲除小鼠均為雜合子, 雌雄交配后，其后代可能出現(xiàn)純合子、雜合子和野生型3種基因型。后期繁育過程中發(fā)現(xiàn)GalR2的基因缺失導(dǎo)致GalR2基因敲除小鼠相對于野生型小鼠性情溫和，易受驚嚇，雜合子和純合子敲除小鼠均具有生殖能力。小鼠的這種行為表現(xiàn)與其他課題組的研究結(jié)果相似[8-11]。但在此篇文章中并未對小鼠的行為學(xué)進行進一步的研究或與前人的工作比較，因此，后期還需要對CRISPR-Cas9技術(shù)制備而得的基因敲除小鼠進行進一步的探究。此外，為獲得更多子代小鼠，必須使用雜合子小鼠進行配種，通過PCR等方法鑒定其子代基因型。GalR2敲除雌鼠的成長發(fā)育較雄鼠慢，因此，雄性幼鼠的生長速度與雌鼠相比要快，且成年后雄鼠的體質(zhì)量增長速率也比GalR2敲除雌鼠和GalR2野生型雄雌小鼠明顯增大，17周齡的雄、雌鼠平均體質(zhì)量分別為21.92 g和30.14 g，17周后，兩者的體質(zhì)量增長速率趨緩；29周后，雌雄鼠之間的體質(zhì)量差異越來越大，雄鼠的體質(zhì)量平均值可達37.33 g，雌鼠的體質(zhì)量平均值為27.28 g。說明GalR2的缺失在幼鼠的生長發(fā)育過程中具有一定的影響，此現(xiàn)象也與此前研究報道中提及的Spexin表達水平與體質(zhì)量呈負相關(guān)研究結(jié)果一致[14-15]。

有研究表明，在角叉菜膠致大鼠足腫脹急性炎癥模型中，神經(jīng)元上的GalR1和GalR2在mRNA水平上的表達分別抑制和增加[16-17]；Spexin在肥胖小鼠模型和臨床樣本中均發(fā)現(xiàn)其具有抗肥胖和抗2型糖尿病的作用；而且在本課題組的研究中發(fā)現(xiàn)，Spexin能通過同時抑制GalR2和GalR3表達調(diào)節(jié)小鼠膽汁酸和肝中膽固醇7α-羥化酶的表達，表明Spexin在膽汁酸代謝調(diào)節(jié)中具有重要的作用[18]，但是Galanin和Spexin在這些方面的作用機制是通過GalR1、GalR2或是GalR3尚未可知。因此，GalR2單基因敲除小鼠模型的建立可為有效特異地針對GalR2蛋白相關(guān)的疾病研究提供必要條件，并為研究相關(guān)疾病靶向藥物夯實基礎(chǔ)。

目前，暫未有國內(nèi)其他課題組對GalR2基因敲除小鼠進行研究。本研究中使用的GalR2基因敲除小鼠是國內(nèi)首次建立的該基因的相關(guān)模型動物，也是在國內(nèi)外首次使用新型基因編輯技術(shù)建立的敲除小鼠模型，因此，為深入研究GalR2基因敲除小鼠不同器官、組織和細胞的生理病理過程提供了必要的條件，也為進一步探究相較于使用反轉(zhuǎn)錄病毒誘變方法和本研究使用的CRISPR-Cas9技術(shù)建立的該模型小鼠在行為學(xué)和生理方面有何差異奠定了基礎(chǔ)。