慢性阻塞性肺疾病動物模型的研究與開發

羅玉馨，胡曉佳，曹竟尹，嚴成俊

(西安培華學院，西安 710125)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)以長期氣流受限為主，其氣流受限多呈進行性發展，預防和根治比較困難。COPD的產生原因主要是人體氣道和肺部產生炎癥或有毒氣體進入肺部，最終導致COPD。其主要癥狀表現為患者出現慢性支氣管炎或肺氣腫[1-2]。這是一種可以使人喪失勞動能力甚至喪失生活自理能力的嚴重疾病。近年來，COPD的患病率和病死率在世界各國仍居高不下。預計10年后，COPD將成為全球三大死因之一[3-5]。COPD的長期治療將給患者和家庭帶來了沉重的經濟負擔[6]，故對其進行深入的研究具有現實意義。本實驗研究能否順利開展的主要前提是動物模型的成功建立，并深入研究和分析動物發生COPD的原因和規律，為治療和預防COPD提供科學的理論依據。

1 實驗動物的選取

構建COPD動物模型的動物種類主要是嚙齒類動物，如豚鼠、小鼠、大鼠、倉鼠、斑點鼠等。而哺乳動物主要是兔、犬、羊、豬、猴等。其中，最常用的是小鼠和大鼠，但大鼠多作為發現病理機制的參考。

1.1 豚鼠

豚鼠嗅覺較靈敏，對各種刺激均會作出極敏感的反應，故在渾濁空氣中患肺炎的概率較高。此外，豚鼠的解剖特征與生理特征和人類高度相似，其主要表現為肺部呈左二右三的肺葉結構，同時具有二分叉細支結構。動物的變態反應與人類的炎癥反應基本相似，由于豚鼠肺損傷主要特征體現在軸突反射，而人類的肺損傷軸突反射情況并不顯著，加上豚鼠價格非常高，無法獲得更多的能夠供血給藥的豚鼠尾巴，所以豚鼠做為實驗動物的機會較低。

1.2 小鼠

小鼠體型較小，好飼養，繁殖時間短且繁殖后代多，可以在有限的空間進行大規模的養殖，十分有利于大規模實驗造模。此外，小鼠基因結構較清楚，與人類在基因水平上高度同源。基因草圖顯示，DNA鏈上的基因與基因之間的片段十分相似，兩物種基因屬都在3萬個左右。在進行小組實驗改造時，可采用易制備基因。對近交系小鼠進行實驗時，可直接排除掉遺傳變異的影響。按照本次實驗的目的要求，可以適當選擇一些敏感性較高品類的小鼠，或者選擇一些體內含有豐富酶及抗體的品類小鼠，這有助于實驗中開展抗原鑒定測驗、免疫印跡測驗、胞流式測驗等其他檢測。有關文獻證明，不同品種的小鼠對煙霧的敏感性不同。Limjunyawong等[7]發現，BALB/cJ小鼠相對于C57BL/6J小鼠，對外源性蛋白酶刺激有更強的敏感性[8]。

1.3 大鼠

大鼠用作動物模型的優缺點類似于小鼠。大鼠與小鼠相比較，大鼠的體積大，方便靜脈注射及進行肺組織和肺泡標本的采集。但大鼠肺部缺少支氣管黏膜下腺體，此特征與人體肺部結構不同，所以大鼠僅可作為發現病理機制的參考。

1.4 其他鼠類

倉鼠、斑點鼠和金黃地鼠等品系的鼠種也能用于COPD模型[9]的構建，但實驗試劑相對較少，動物價格較高，且易受到遺傳變異等因素的影響，實驗條件苛刻，不利于實驗的順利展開[6]，所以不作為造模動物實驗的首選動物。

1.5 其他動物

兔、犬、猴、羊、豬等動物雖與人類肺部結構高度相似，但價格高，難飼養，顯然在數量巨大的造模動物實驗中并不適用。使雪貂的鼻子暴露在香煙煙霧(CS)下6個月后，雪貂就出現了一系列明顯的細菌感染的病理特征。例如，在清晨的時候，雪貂就出現了伴有氣道阻塞的咳嗽(自發性咳嗽)、慢性黏液高分泌以及以氣道為中心的細菌感染。雪貂的這些表征與大鼠、小鼠相比較，更接近于人類COPD的病理特征，但在檢測中卻沒有發現明顯升高的組織阻尼，這個結果與人類患COPD的特征有很大差異，所以還需要做進一步研究[10]。

實驗動物的選取應滿足某些與人類相似的特征和生理結構。通過動物實驗，對人類疾病的發生和發展規律進行推測和探究，故本試驗裝置系統選用結構簡單又能直接反映研究指標的動物—小鼠。

2 構建COPD的常用方法

在構建COPD模型時，通常采用的方法包括煙草煙霧暴露法、基因改造法等，同時空氣污染物質暴露法、多因素聯合誘導法也是構建這種模型進行實驗的常用方法。有研究認為，吸煙為 COPD 最重要的誘導因素之一，所以通常情況下，在構建這種模型時普遍會選擇煙草煙霧暴露法，以此達到較好的實驗效果。

2.1 氣道內蛋白酶滴注法

肺組織能維持正常的結構主要是由于蛋白酶和抗蛋白酶兩個重要因素的平衡，以保證其免受破壞和損傷。若某一方增加或減少，均會引起失衡，導致肺組織損傷。以蛋白酶誘導模型作為單一的致病因素，常用豬胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、人中性粒細胞彈性蛋白酶等。給予小鼠鼻內單次滴注蛋白酶，產生的肺氣腫現象基本符合COPD的主要特征，此法容易誘導明顯的肺氣腫，顯著地體現出異常的肺功能現象。

2.2 基因改造法

環境污染以及吸煙問題導致人類患有COPD的情況越發嚴重。辛亞男等[11]研究結果說明吸煙是COPD重要誘導因素之一。但在吸煙人群中，并不是所有吸煙者都是患病者，個體易患因素應得到研究者的重視。當前，基因調控模型有很多類型，如基因過度表達模型、常見的基因缺失COPD模型以及自然基因變異模型。李麗球等[12]研究表明，在小鼠體內，抗氧化酶與抗蛋白酶對其身體所產生的破壞程度有著很大的差異，因此通過改變動物的基因和COPD的發病機制，找出引發COPD的一些誘導原因，使實驗者發現更好的治療辦法。

2.3 多因素聯合法

單因素誘導方法于實驗中相對簡單經濟且更易獲得可觀的實驗結果。但COPD患者病因復雜，且COPD有較高的分級，單一的造模方法耗時長，且難以同時模擬多種復雜的病理特征和生理病理改變情況，所以多因素聯合法更加省時省力，實驗中可以更好的模擬COPD的典型特征以及病理生理改變情況，以達到更穩定的實驗效果。

2.4 腹腔注射法

在動物腹腔內注射煙草煙霧提取化合物或者注射異種內皮細胞。香煙煙霧提取物(CSE)容易制備，價格低廉，操作較簡單，而且建模時間短，可通過腹腔注射CSE來構建COPD動物模型。將自制的CSE溶液于相隔的天數中注入等量的劑量，經過12周的實驗期以后，實驗人員發現，小鼠出現肺功能下降情況，大鼠在3周后即誘導出COPD模型，其原因主要是由于小鼠體內肺泡腔不斷變大，肺泡破損，周圍的細胞死亡數量也開始增加，導致肺功能下降，符合COPD模型的建立。腹腔注射異種內皮細胞建立COPD模型，由于建模時間短，沒有出現顯著的病理變化。COPD發病機制為異種內皮細胞使機體在一段時間后產生抗體細胞并逐漸增多，人體內的免疫功能開始失衡，肺組織遭到破損，肺細胞死亡量開始逐漸增加，最終導致肺氣腫的發生。

2.5 脂多糖誘導法

在革蘭陰性菌細胞壁組成中，脂多糖是最主要的一種成分。脂多糖是一種內毒素，可以刺激內皮細胞、中性粒細胞以及單核細胞等釋放炎性介質，使其發生反應，最終造成蛋白酶-抗蛋白酶失衡，嚴重損壞肺組織，導致肺氣腫。脂多糖的誘導模型常采用氣管內滴注法，其建模時間較短，操作簡便，可以模擬COPD機制的急性加重反應，但不能模擬其慢性病變的過程，只能復制出COPD機制的部分病理特征，可與其他方法聯合使用[13]。

3 COPD試驗系統裝置的研究與開發

該裝置包括香煙煙霧的利用、整套工藝系統裝置的處理凈化(整套工藝系統外表面材料選用透明玻璃)。如圖1。

圖1 COPD試驗系統裝置Fig.1 COPD test system device

3.1 香煙煙霧發生器

進行實驗過程中，為確保香煙煙霧均勻地擴散到活動室頂部，通常情況下會將通風口設置到活動室下層的中間，這樣才可以確保活動室內的香煙煙霧完全進入動物肺部，被動物充分吸入，并保證動物能夠在一個舒適的環境中生存。

3.2 動物活動室

上層為動物活動室、食物投放盒以及飲水投放盒三個格擋。每個格擋均可單獨打開進行試驗操作、投放動物、投放動物食物、投放飲水等，操作靈活簡單。在動物活動室當中，實驗員安裝了兩個溫濕度裝置，同時還安裝了一個監控裝置，進而方便實驗員通過監控設備觀察動物在該場所中吸入CO的濃度、含氧量、溫度、濕度等關鍵參數。

3.3 香煙出口控制閥及通風口

進行實驗時，可以利用香煙出口控制閥或通風口抽屜對動物活動室內的環境進行調節和控制。如可以控制和調節內部環境CO的濃度參數，也可以調節環境內含氧量參數等，使動物的生存環境能夠滿足實驗要求。

3.4 凈化罐

試驗裝置尾部凈化罐包含排煙管道、控制閥、風機、凈化罐。其中，凈化罐內布置下層活性炭蓬松氈過濾網和上層活性炭蓬松氈過濾網，這兩個過濾網可以對沒有得到利用的相應環境進行凈化處理，保證周圍空氣不會對實驗環境造成污染以及影響試驗人員的健康。

此裝置可有效監控整個實驗過程中煙霧的成分、濃度、溫度、濕度，同時使煙霧循環利用，徹底解決實驗過程中造成試驗效果欠佳的問題。

4 結語

建立動物模型的首要基礎是研究疾病的預防、新藥的研發以及新療法。裝置合格的模型可以使臨床研究順利開展。在實驗室的眾多研究成果中，該環節在臨床中的應用不可或缺。至今，我國醫藥技術行業仍然在持續尋找能夠與動物造模相匹配的辦法，以期實現規范化。目前，更符合COPD發病機制復雜的條件是應用復合因素造模，但需要通過多個方面標準的評價與考查，確定存在特殊病理的改變、通氣功能的限制等因素，來確定模型是否符合標準。

隨著科學技術的不斷創新和發展，更先進的動物模型以及更全面的評價系統的出現可為后續研究COPD提供更多的幫助。