ε-聚賴氨酸復(fù)合保鮮劑對雞毛菜品質(zhì)及微生物的影響

韓揚，朱成志，李沁雨，李立，馬新新，趙志軍，包怡紅*

1(東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150040)2(中國科學(xué)院上海高等研究院 綠色化學(xué)工程研究中心，上海，201210)3(上?？萍即髮W(xué) 生命學(xué)院，上海，201210)4(上海清美綠色食品(集團)有限公司，上海，201399)

雞毛菜(BrassicarapaL.Chinensis Group.)屬十字花科蔬菜，又名青菜，是小白菜幼苗的俗稱[1]，因富含胡蘿卜素、抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)以及多種礦物質(zhì)而深受市場歡迎[2]。然而雞毛菜作為鮮嫩葉類菜，采后極易受到微生物污染而發(fā)生腐敗，貯存期平均損耗率達30%以上[3]，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。目前雞毛菜主要采用物理低溫的方式進行貯存保鮮[4]，最佳貯存時間為3～5 d，而市場上尚未見專用于雞毛菜的保鮮劑。目前常見的蔬菜保鮮劑多為化學(xué)保鮮劑[5-7]，隨著人們對食品安全要求的日益提高，研究和開發(fā)適用于雞毛菜等嫩葉類蔬菜保鮮的天然、綠色保鮮劑，對降低蔬菜損耗，促進產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展具有重要意義。

嫩葉類蔬菜水分含量高、營養(yǎng)豐富，使得采摘后蔬菜切口處污染的微生物得以快速繁殖，造成蔬菜品質(zhì)大幅下降，因此，嫩葉類蔬菜的微生物控制成為其貯存保鮮的關(guān)鍵因素之一[8]。ε-聚賴氨酸(ε-polylysine，ε-PL)是一種由白色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的新型天然抑菌物質(zhì)，具有安全性高、抗菌譜廣、作用pH范圍寬、熱穩(wěn)定性高等優(yōu)點[9]。其在日本、美國等國家食品行業(yè)中獲得廣泛應(yīng)用。2014年國家衛(wèi)計委批準(zhǔn)ε-聚賴氨酸鹽酸鹽在蔬菜保鮮中應(yīng)用，目前國內(nèi)仍以實驗研究階段為主[10-11]。FAN等[10]采用23 W/L超聲和0.4 g/L ε-PL復(fù)合處理鮮切萵苣，其微生物增長受到抑制，4 ℃貯藏12 d，AsA含量減少量降低了44.02%。李立[11]使用0.10 g/L的ε-PL和10 g/L的AsA溶液浸泡鮮切杭白菜，低溫貯藏7 d，質(zhì)量損失率不超過4%，色澤等感官指標(biāo)維護較好。

本文以嫩葉蔬菜雞毛菜為研究對象，考察ε-PL復(fù)合肉桂提取物(cinnamon extract,CE)對雞毛菜品質(zhì)及微生物的影響，響應(yīng)面優(yōu)化ε-PL與肉桂提取物的復(fù)配比例，并最終通過高通量測序技術(shù)探討ε-PL復(fù)合肉桂提取物對雞毛菜菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，解析復(fù)合保鮮劑的抑菌保鮮機制，為其在嫩葉類蔬菜保鮮中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：雞毛菜品種為“華王”，購于上海市乾溪菜市場。

試劑：ε-PL，浙江新銀象生物工程有限公司；肉桂提取物，湖南先偉實業(yè)有限公司；抗壞血酸，鄭州偉豐生物科技有限公司；其他試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME3002電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；BCD-312 WDPV電冰箱，上海海爾集團公司；SW-CJ-2FD凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZXDP-A2160電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DK-8D電熱恒溫水槽，上海恒一科學(xué)儀器有限公司；SCIENTZ-11L無菌均質(zhì)器，寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將新鮮雞毛菜分成兩組，對照組(CK)和試驗組(T)，對照組用純凈水浸泡，試驗組用復(fù)合保鮮劑溶液浸泡后撈出，瀝干雞毛菜表面多余水分，裝入保鮮袋，4 ℃貯藏，每3 d(試驗當(dāng)天為第1天)測定雞毛菜的菌落總數(shù)及AsA含量。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

單因素試驗中，研究ε-PL質(zhì)量濃度對雞毛菜貯藏品質(zhì)的影響時，作用時間為10 min，CE的質(zhì)量濃度為0.40 g/L，ε-PL的質(zhì)量濃度分別為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 g/L；研究CE質(zhì)量濃度對雞毛菜貯藏品質(zhì)的影響時，作用時間為10 min，ε-PL的質(zhì)量濃度為0.40 g/L，CE的質(zhì)量濃度分別為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 g/L；研究作用時間對雞毛菜貯藏品質(zhì)的影響時，CE的質(zhì)量濃度為0.40 g/L，ε-PL的質(zhì)量濃度為0.40 g/L，作用時間分別為5、10、15、20、25 min。

1.3.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇ε-PL質(zhì)量濃度、CE質(zhì)量濃度以及作用時間作Box-Behnken試驗設(shè)計，以4 ℃貯藏13 d的雞毛菜的菌落總數(shù)(Y1)和AsA含量(Y2)為響應(yīng)值，試驗因素和水平設(shè)計見表1?？疾鞆?fù)合保鮮劑對雞毛菜貯藏品質(zhì)的影響。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平

1.3.4 復(fù)合保鮮劑效果驗證

根據(jù)響應(yīng)面試驗得到的最佳保鮮劑配方，測定雞毛菜的菌落總數(shù)和AsA含量，驗證復(fù)合保鮮劑對雞毛菜貯藏品質(zhì)的影響，并測定雞毛菜的微生物多樣性，分析復(fù)合保鮮劑的作用機制。

1.3.5 指標(biāo)測定

AsA含量測定：參照GB 5009.86—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中抗壞血酸的測定》，采用2,6-二氯靛酚滴定法。菌落總數(shù)測定：參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》。微生物多樣性測定：蔬菜樣品取0.5 g于超低溫冰箱保存，送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用Illumina MiSeq測序技術(shù)進行樣品測定，并進行聚類和多樣性分析。感官評價參照表2。

表2 雞毛菜的感官評分

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復(fù)3次，取平均值。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用IBM SPSS Statistics 26.0，制圖軟件采用Origin 8.0，響應(yīng)面試驗設(shè)計采用Design-expert 12.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗分析

2.1.1 ε-PL質(zhì)量濃度對雞毛菜菌落總數(shù)和保鮮效果的影響

雞毛菜營養(yǎng)豐富，含水量高，容易滋生微生物發(fā)生腐敗變質(zhì)[12]。由圖1-a可知，保鮮劑組在貯存期1～7 d，對雞毛菜微生物控制均顯著好于CK組(P<0.05)。CK組菌落總數(shù)從第1天的5.39 lgCFU/g增加至6.43 lgCFU/g，增長量為19.29%，已經(jīng)腐敗變質(zhì)；而僅添加0.20 g/L ε-PL+0.40 g/L CE的保鮮劑組菌落總數(shù)為5.86 lgCFU/g，增長量降低了8.73%，雞毛菜感官品質(zhì)良好；在7～13 d，發(fā)現(xiàn)試驗中ε-PL和CE復(fù)合保鮮劑組的抑菌效果明顯優(yōu)于CE單獨使用時的抑菌效果(P<0.05)，表明盡管CE同樣具有一定的抑菌作用，但ε-PL和CE復(fù)合保鮮劑表現(xiàn)出更佳的抑菌特性。同時發(fā)現(xiàn)在7～13 d，0.60～1.0 g/L ε-PL+0.40 g/L CE復(fù)合保鮮劑組的菌落總數(shù)接近，但明顯小于0.20～0.40 g/L ε-PL+0.40 g/L CE復(fù)合保鮮劑組的菌落總數(shù)(P<0.05)，說明現(xiàn)有體系中，0.60 g/L的ε-PL質(zhì)量濃度已經(jīng)達到較好抑菌效果。

AsA是重要的抗氧化物質(zhì)，是蔬菜營養(yǎng)品質(zhì)的重要理化指標(biāo)。由圖1-c可知，雞毛菜貯藏過程中AsA含量呈下降趨勢。1～7 d，CK組雞毛菜的AsA含量下降了58.89%，感官評分為42.50分，雞毛菜發(fā)生腐爛，失去商業(yè)價值，而同時復(fù)合保鮮劑組的AsA含量僅下降了25.25%～33.16%，感官評分為72.90～87.00分，雞毛菜菜葉鮮綠、無褶皺，品質(zhì)仍良好。第10天，單獨使用CE的保鮮劑組，AsA含量下降了61.52%，雞毛菜褶皺卷曲，出現(xiàn)異味，失去商業(yè)價值，但同時ε-PL和CE復(fù)合保鮮劑組的AsA下降量為29.82%～42.24%，僅出現(xiàn)少數(shù)綠葉邊緣卷曲，無異味，進一步說明ε-PL通過增強微生物控制，可以達到對雞毛菜的抗氧化性和感官品質(zhì)的保護作用；第13天，復(fù)合保鮮劑組的AsA減少量達到40.00%以上，雞毛菜均出現(xiàn)褶皺，蔬菜開始出現(xiàn)異味，接近貯存極限；其中，0.60 g/L ε-PL+0.40 g/L CE保鮮劑組的感官評分較優(yōu)于其他組(P<0.05)(圖1-b、圖1-c)。袁園等[13]利用等離子體活化水處理鮮切生菜，4 ℃貯藏4 d AsA損失量為29.30%，貯藏10 d菌落總數(shù)達到6.22 lgCFU/g，而本試驗0.60 g/L ε-PL+0.40 g/L CE復(fù)合保鮮劑組，雞毛菜4 ℃貯藏7 d AsA損失量為25.25%，貯藏10 d菌落總數(shù)達到5.80 lgCFU/g，說明保鮮效果較好。

a-ε-PL質(zhì)量濃度對雞毛菜菌落總數(shù)的影響；b-ε-PL質(zhì)量濃度對雞毛菜感官評分的影響；c-ε-PL質(zhì)量濃度對雞毛菜抗壞血酸含量的影響

2.1.2 CE質(zhì)量濃度對雞毛菜菌落總數(shù)和保鮮效果的影響

CE的主要成分是肉桂醛，具有強抗氧化性和較好的抑菌性[14]。由圖2-a可知，隨著CE質(zhì)量濃度的增加，雞毛菜中的微生物菌落總數(shù)增長速率總體呈現(xiàn)減緩趨勢，其中，0.60～1.0 g/L CE+0.40 g/L ε-PL復(fù)合保鮮劑組的菌落總數(shù)差別小于4%(以0.60 g/L CE+0.40 g/L ε-PL的數(shù)據(jù)為參照點)，可見0.60 g/L CE已經(jīng)達到抑菌平衡濃度。由圖2-b、圖2-c可知，CK組第7天感官評分46.40分，AsA含量下降67.32%，菜葉出現(xiàn)腐爛；單獨使用0.40 g/L ε-PL保鮮劑組在第10天感官評分降低至46.80分，AsA含量下降66.34%，失去商業(yè)價值。相比之下，不同質(zhì)量濃度的CE的添加有效減緩了AsA的損失(P<0.05)，維護了雞毛菜的感官品質(zhì)。此外，貯存期內(nèi)，0.60 g/L CE+0.40 g/L ε-PL組的AsA減少量顯著低于其他組(P<0.05)，可見成分較為復(fù)雜的CE作用是綜合的，當(dāng)質(zhì)量濃度超過一定限度時，保鮮作用反而下降，因此將0.60 g/L CE作為Box-Behnken試驗設(shè)計的中心點。

a-CE質(zhì)量濃度對雞毛菜菌落總數(shù)的影響；b-CE質(zhì)量濃度對雞毛菜感官評分的影響；c-CE質(zhì)量濃度對雞毛菜抗壞血酸含量的影響

2.1.3 作用時間對雞毛菜菌落總數(shù)和保鮮效果的影響

雞毛菜對復(fù)合保鮮劑吸收需要時間，如圖3-a～圖3-c所示，復(fù)合保鮮劑的作用作用時間越長，雞毛菜微生物菌落總數(shù)上升越慢，AsA損失率越低。然而當(dāng)作用時間超過20 min時，復(fù)合保鮮劑組之間的菌落總數(shù)、AsA含量和感官評分無顯著差異(P>0.05)。例如：在第13天，作用時間20 min與25 min時菌落總數(shù)、AsA含量和感官評分差異僅分別為2.25%、1.75%和3.40分。因此選擇20 min作為Box-Behnken試驗設(shè)計的中心點。

a-作用時間對雞毛菜菌落總數(shù)的影響；b-作用時間對雞毛菜感官評分的影響；c-作用時間對雞毛菜抗壞血酸含量的影響

2.2 響應(yīng)面試驗分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對CE質(zhì)量濃度、ε-PL質(zhì)量濃度以及保鮮劑作用時間進行Box-Behnken試驗，以4 ℃貯藏13 d的雞毛菜的菌落總數(shù)(Y1)和AsA含量(Y2)為響應(yīng)值。Box-Behnken試驗及結(jié)果見表3。利用Design-expert 12.0軟件對表3的數(shù)據(jù)進行分析，得到菌落總數(shù)(Y1)的回歸模型為Y1=5.42-0.02A+0.04B+0.04C+0.06AB-0.05AC+0.01BC+0.07A2+0.17B2+0.10C2。AsA含量(Y2)的回歸模型為Y2=50.53+1.04A-1.72B-2.17C+3.85AB-0.71AC-0.20BC-11.48A2-4.99B2-6.26C2。由表4回歸模型的方差分析表明，該回歸模型能夠很好地擬合試驗結(jié)果，模型擬合程度良好，可用該模型回歸方程預(yù)測雞毛菜保鮮條件的優(yōu)化。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果

表4 回歸模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化配方結(jié)果與試驗驗證

通過對響應(yīng)面結(jié)果與回歸方程進行分析，菌落總數(shù)有最小值，AsA含量有最大值，預(yù)測得到雞毛菜最佳保鮮條件，在ε-PL質(zhì)量濃度0.57 g/L，CE質(zhì)量濃度0.62 g/L 和作用時間19.01 min條件下，雞毛菜貯藏4 ℃貯存13 d時的菌落總數(shù)為5.41 lgCFU/g，AsA含量為50.79 mg/100g。為考察結(jié)果的準(zhǔn)確性進行驗證試驗，結(jié)合實際情況，將作用時間設(shè)置為19.00 min，結(jié)果顯示雞毛菜在4 ℃貯藏13 d時的菌落總數(shù)為5.42 lgCFU/g，AsA含量為50.40 mg/100g，基本符合預(yù)期值，即該模型與實際試驗擬合良好，表明響應(yīng)曲面優(yōu)化的條件具有較高的可靠性。

2.3 ε-PL復(fù)合CE對雞毛菜貯藏品質(zhì)的影響

考察了ε-PL復(fù)合CE的最佳條件(ε-PL質(zhì)量濃度0.57 g/L、CE質(zhì)量濃度0.62 g/L和作用時間19.00 min)對雞毛菜品質(zhì)的影響。由圖4所示，0.57 g/L ε-PL+0.62 g/L CE+19.00 min組保鮮條件下，雞毛菜貯藏13 d后，菌落總數(shù)顯著低于單因素時的菌落總數(shù)(P<0.05)；同時，雞毛菜的AsA含量僅損失17.00%，葉片鮮綠、基本無褶皺卷曲現(xiàn)象、葉梗硬挺度減少不明顯，感官分?jǐn)?shù)達到83.50分，商業(yè)價值良好，突破了單因素貯藏13 d的貯藏極限。

圖4 復(fù)合保鮮劑的作用方式對雞毛菜菌落總數(shù)、感官評分、抗壞血酸含量的影響

2.4 復(fù)合保鮮劑對微生物多樣性的影響

2.4.1 Alpha多樣性分析

添加最優(yōu)配方復(fù)合保鮮劑對雞毛菜貯藏過程中微生物的Alpha多樣性指數(shù)的影響見表5。經(jīng)測定，各組雞毛菜樣品完整性參數(shù)覆蓋度均在99%以上，表明測序結(jié)果可有效地用于樣品微生物多樣性分析。表5中的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)與物種多樣性有關(guān)；Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，樣品中微生物多樣性越豐富。

由表5可知，T組第1天的Shannon指數(shù)僅為CK組75.77%，表明經(jīng)過復(fù)合保鮮劑處理后，雞毛菜中的部分微生物生長受到抑制，微生物多樣性明顯降低。此外，在1～7 d，CK組和T組試驗的Shannon指數(shù)均呈下降趨勢，但CK組降低了36.52%，而T組僅降低了14.86%，表明保鮮劑處理后，并沒有完全抑制各類微生物的生長，但是有效延緩了微生物群落的結(jié)構(gòu)變化。

表5 雞毛菜樣品Alpha多樣性指數(shù)

2.4.2 Beta多樣性分析

通過Beta多樣性可以分析不同蔬菜樣品中微生物群落組成的差異性見圖5。CK1與T1的距離遠，表明CK1的微生物群落組成與T1的微生物群落組成差異性強，說明復(fù)合保鮮劑的處理使得雞毛菜中微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。CK7與T7，CK7與T13的距離有縮小的趨勢，說明當(dāng)雞毛菜的品質(zhì)逐漸下降時，微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性也在縮小。

圖5 雞毛菜樣品細菌菌群主成分分析

2.4.3 雞毛菜貯存過程細菌群落組成分析

蔬菜的腐敗與微生物的生長繁殖有重要關(guān)系，可通過雞毛菜貯藏期間細菌群落組成的變化探究復(fù)合保鮮劑對雞毛菜的作用機制。由圖6可知，CK1樣品中的優(yōu)勢菌屬包括鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas, 37.06%)、甲基桿菌屬(Methylorubrum, 14.59%)、根瘤菌屬(Rhizobium, 11.52%)；而CK7樣品中的優(yōu)勢菌屬包括甲基桿菌屬(60.19%)、鞘氨醇單胞菌屬(22.24%)和代爾夫特菌屬(Delftia, 10.57%)，其中甲基桿菌屬顯著上升(P<0.05)。這表明雞毛菜腐敗過程中，甲基桿菌屬的生長繁殖可能是原因之一。T組樣品中表現(xiàn)出同樣的趨勢，甲基桿菌屬占比由T1的21.64%增加至T13的74.48%，進一步闡釋甲基桿菌屬的生長可能與雞毛菜的品質(zhì)下降相關(guān)。文獻報道，雞毛菜中的優(yōu)勢菌屬均為果蔬常見菌屬[15-20]，其甲基桿菌屬普遍存在于植物葉表[11]，對農(nóng)作物有重要的生長代謝促進作用[17]。因此ε-聚賴氨酸復(fù)合保鮮劑對甲基桿菌屬的生長抑制，有助于減緩其對雞毛菜生理代謝活動的促進作用，進而提升雞毛菜的保鮮效果。

圖6 復(fù)合保鮮劑對雞毛菜細菌群落豐度的影響

2.4.4 雞毛菜貯藏品質(zhì)的相關(guān)性分析

雞毛菜貯藏品質(zhì)的相關(guān)性分析見圖7，AsA含量與甲基桿菌屬、黃桿菌屬和泛菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與鞘氨醇單胞菌屬、根瘤菌屬呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；而菌落總數(shù)與鞘氨醇單胞菌屬、根瘤菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與甲基桿菌屬、黃桿菌屬和泛菌屬呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果進一步闡釋，甲基桿菌屬的生長繁殖是雞毛菜菌落總數(shù)增加的主因，它同時促進了AsA含量的下降。

圖7 雞毛菜貯藏品質(zhì)的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

本文針對雞毛菜水分含量高、營養(yǎng)豐富，易滋生微生物發(fā)生腐敗變質(zhì)的特征，探究ε-PL復(fù)合肉桂提取物對貯藏期雞毛菜品質(zhì)及微生物的影響。得到結(jié)論如下：

(1) 單因素試驗中ε-PL復(fù)合肉桂提取物有效減緩了微生物的生長繁殖速度和雞毛菜AsA的損失率，使得對照組貯藏7 d腐敗變質(zhì)的情況下，復(fù)合保鮮劑組仍能保持葉片鮮綠、基本無卷曲的良好感官品質(zhì)；

(2) 經(jīng)過響應(yīng)面試驗配方優(yōu)化，在復(fù)合保鮮劑最佳條件下，雞毛菜貯藏13 d，菌落總數(shù)和AsA含量理化指標(biāo)均顯著優(yōu)于單因素相應(yīng)數(shù)值(P<0.05)，保障了雞毛菜商業(yè)價值，突破了單因素貯藏13 d的貯藏極限；

(3) 微生物多樣性的分析結(jié)果表明，ε-PL復(fù)合保鮮劑改變了雞毛菜的微生物菌群結(jié)構(gòu)，降低了微生物的多樣性，尤其是降低了與AsA含量顯著負(fù)相關(guān)的甲基桿菌屬菌的生長繁殖速度，進而解析了復(fù)合保鮮劑抑菌保鮮的機制。