D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶在枯草芽孢桿菌中的表達

胡夢瑩，李夢麗，江波，張濤

(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

國際稀有糖協(xié)會將自然界中很少存在的單糖和糖醇定義為稀有糖，D-阿洛酮糖就是其中的一種，它是D-果糖在C-3位上的差向異構(gòu)體[1]，早在2014年就被美國食品藥品監(jiān)督管理局列為一般安全，允許將其添加在食品、膳食補充劑以及醫(yī)藥制劑中[2]。D-阿洛酮糖具有許多有益人體健康的特殊功能[3]，例如攝入適量的D-阿洛酮糖可以降低血糖血脂水平[4]、減少脂肪堆積[5]、清除活性氧[6]的活性等。且當人體攝入D-阿洛酮糖后，生成的熱量較低，僅為同等質(zhì)量蔗糖的0.3%[7]，因此被美國食品導(dǎo)航網(wǎng)評為最具潛力的蔗糖替代品。

目前D-阿洛酮糖的生產(chǎn)主要依賴于酶法生產(chǎn)，這主要是因為其在自然界中含量稀少，直接提取不符合經(jīng)濟效益，而化學(xué)合成法會產(chǎn)生副產(chǎn)物，增加生產(chǎn)成本[8]。而酶法生產(chǎn)中最關(guān)鍵的酶是D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase，DPE)，它可以將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖。野生型菌株的產(chǎn)酶量遠遠低于預(yù)期，無法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，因此，有必要構(gòu)建合適的表達載體并在異源生物中表達。枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌[9]，具有較為清晰的研究背景[10]，發(fā)酵周期短、分泌能力強且是食品級安全菌株，是一個較好的表達宿主[11]。

本研究中將ClostridiumscindensATCC 35704來源的DPE，在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)WB800中進行異源表達，通過篩選單啟動子/串聯(lián)啟動子，優(yōu)化核糖體結(jié)合位點序列，從而提高DPE的表達量，為DPE生產(chǎn)應(yīng)用于食品行業(yè)提供實驗數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、B.subtilisWB800為實驗室保藏；穿梭質(zhì)粒pP43 NMK由實驗室保存；質(zhì)粒PUB-dpe由實驗室前期構(gòu)建而成[12]。

1.1.2 試劑

Phanta Max Super-Fidelity DAN Polymerase、ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit、質(zhì)粒快速抽提試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；超級感受態(tài)細胞制備試劑盒、細菌DNA基因組提取試劑盒、4S Green Plus無毒核酸染料、瓊脂糖、50×TAE 緩沖液，上海生工生物工程有限公司；DNA Marker、10×Loading Buffer，TaKaRa(大連生物有限公司)；PAGE凝膠快速制備試劑盒、蛋白質(zhì)marker，5×蛋白上樣緩沖液，上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨及其他常用試劑，國藥集團。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，121 ℃高壓滅菌20 min(固體中需額外添加20 g/L瓊脂)。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖15，蛋白胨10，酵母浸粉20，NaCl 8，Na2HPO4·12H2O 1，MgSO4·7H2O 1，調(diào)節(jié)pH至7.0，115 ℃高壓滅菌30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物的設(shè)計

本文所用的引物如表1所示，由蘇州金唯智生物科技有限公司所合成。

表1 本研究中涉及的所有引物

1.2.2 pP43 NMK-promoter-DPE單啟動子表達質(zhì)粒的構(gòu)建及克隆

利用不同啟動子的引物對Promoter-F/R(表1)，以B.subtilis168基因組為模板，通過PCR技術(shù)擴增得到啟動子PamyE、PaprE、PgsiB、Phag、PnprE、P43、PsigX、PylbP片段，以實驗室保存的質(zhì)粒PMA5為模板，通過PCR技術(shù)擴增得到啟動子PHpaII片段。以實驗室保存的質(zhì)粒PUB-DPE為模板，利用不同的引物對DPE(prometer)-F/DPE-R，通過PCR技術(shù)擴增得到DPE片段。其中引物Promoter-R與引物DPE(promoter)-F有15～20 bp的同源臂，利用重疊PCR可將Promoter片段與DPE片段進行融合，形成新片段Promoter-DPE。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和膠回收，在-20 ℃保存。以實驗室保存質(zhì)粒pP43 NMK為模板，利用引物對P-F/R，去除原有啟動子序列，進行PCR線性化擴增。其中引物Promoter-F、DPE-R分別與引物P-R、P-F有15～20 bp的同源臂，通過ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒，將Promoter-DPE片段和線性化pP43 NMK片段環(huán)化后構(gòu)建含不同單啟動子的載體pP43 NMK-promoter-DPE。

通過超級感受態(tài)細胞制備試劑盒制備E.coliDH5α感受態(tài)細胞，并按照說明書方法將pP43 NMK-promoter-DPE轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，將重組細胞涂布在LB 氨芐(100 mg/L)抗性固體平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子，篩選驗證測序。將測序驗證正確的質(zhì)粒pP43 NMK-promoter-DPE轉(zhuǎn)至B.subtilisWB800感受態(tài)細胞，將重組細胞涂布在LB卡那(50 mg/L)抗性固體平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子，測序正確后即得到重組菌株B.subtilisWB800/pP43 NMK-promoter-DPE。

1.2.3 pP43 NMK-promoter1-promoter2-DPE串聯(lián)啟動子表達質(zhì)粒的構(gòu)建及克隆

以1.2.2中構(gòu)建的含有不同單啟動子pP43 NMK-promoter-dpe質(zhì)粒為模板，利用引物對P-F、Promoter1(promoter2)-R，通過PCR技術(shù)擴增pP43 NMK-Promoter1片段，利用引物對(promoter1)Promoter2-F、DPE-R，通過PCR技術(shù)擴增Promoter2-DPE片段，其中引物P-F、Promoter1(promoter2)-R分別和引物DPE-R、(promoter1)Promoter2-F有15～20 bp的同源臂，通過ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒，將pP43 NMK-Promoter1片段和Promoter2-DPE片段環(huán)化后構(gòu)建含不同串聯(lián)啟動子的載體pP43 NMK-promoter1-promoter2-DPE。

按照1.2.2中的轉(zhuǎn)化方法，最后得到重組菌株B.subtilisWB800/pP43 NMK-promoter1-promoter2-DPE。

1.2.4 RBS序列的優(yōu)化

文獻[13]報道絕大多數(shù)細菌中有著通用的SD序列(shine-dalgarno sequence，SD)GGAGG。本文中待優(yōu)化的核糖體結(jié)合位點(ribosome binding site, RBS)同樣具有該SD，以此作為RBS序列的種子區(qū)域，突變前兩個與后兩個堿基。報道中的RBS序列里A、G堿基出現(xiàn)頻率較高[14-16]，因此將前后兩個堿基在A/G中隨機出現(xiàn)，得到包括對照RBS序列在內(nèi)的16種RBS序列。

1.2.5B.subtilisWB800重組菌株的發(fā)酵培養(yǎng)與表達

用接種環(huán)在LB卡那抗性平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種至LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)12 h。將活化后的種子液按3%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)，定時取樣，檢測菌體生長OD600值和DPE酶活力。

1.2.6 酶活力的檢測

吸取1 mL發(fā)酵液，4 000 r/min離心5 min，棄上清液，保留菌體沉淀。用50 mmol/L，pH 7.5的Tris/HCl緩沖液反復(fù)吹洗菌體沉淀后，將其稀釋至合適濃度。取一定量稀釋后的發(fā)酵液，加入到終體積為1 mL 的果糖底物溶液中(50 mmol/L，pH 7.5的Tris/HCl 緩沖液配制，質(zhì)量濃度100 g/L)，55 ℃，反應(yīng)10 min后，高溫煮沸滅酶。將樣品于12 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm 濾膜，制樣，利用HPLC檢測分析。

其中HPLC的檢測條件為：Waters e2695高效液相，流動相為超純水(添加50 mg/L EDTA鈣鹽，超聲15 min)，流速0.4 mL/min；Sugar pak-1鈣型色譜柱，柱溫85 ℃；示差折光檢測器，檢測器溫度30 ℃。

酶活力定義：在55 ℃，pH 7.5的條件下，單位時間(min)生成1 μmolD-阿洛酮糖所需要的酶量為1個酶活力單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同啟動子重組菌株的構(gòu)建

利用表1中的引物，對各個啟動子進行PCR擴增，啟動子片段帶有相應(yīng)的上下游同源臂序列，其PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1 所示，可知啟動子片段大小與預(yù)期一致。當單啟動子重組菌株B.subtilisWB800/pP43 NMK-promoter-DPE構(gòu)建完成后，用質(zhì)粒快速抽提試劑盒抽取該菌株質(zhì)粒，以其為模板，按照1.2.3中的方法，構(gòu)建串聯(lián)啟動子重組菌株pP43 NMK-promoter1-promoter2-DPE，其中pP43 NMK-Promoter1片段和Promoter2-DPE片段PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1，其大小與預(yù)期一致。待轉(zhuǎn)化子測序無誤后，即可獲得重組菌株B.subtilisWB800/pP43 NMK-promoter-DPE和pP43 NMK-promoter1-promoter2-DPE。

a-Promoter片段PCR擴增；b-Promoter2-DPE片段PCR擴增；c-pP43 NMK-Promoter1片段PCR擴增

2.2 單啟動子對重組菌株表達水平的影響

靶基因的有效轉(zhuǎn)錄是蛋白表達的第一步，啟動子在基因組中是重要的調(diào)控元件，能夠決定基因表達的時間和強度[17]。為了進一步提高DPE的表達效果，構(gòu)建了9種啟動子介導(dǎo)的DPE重組表達菌株，并對其進行發(fā)酵產(chǎn)酶，其最大酶活力如圖2所示。本文選用的啟動子均為枯草芽孢桿菌中表達效果較好的啟動子，由圖2和圖3可知，在發(fā)酵產(chǎn)DPE時，不同啟動子介導(dǎo)的DPE表達效果差異較大，但啟動子對菌體的生長情況影響較小，其酶活力最高時OD600值差異較小。其中最優(yōu)單啟動子為Phag，相應(yīng)重組菌株酶活力高達19.62 U/mL，OD600值為12.03，其次是啟動子PylbP和P43，對應(yīng)的酶活力分別為16.62 U/mL和15.05 U/mL，OD600值分別是11.87和11.31。Phag由σD識別，在枯草芽孢桿菌中σD涉及鞭毛基因、運動性基因和自溶素基因及其調(diào)節(jié)因子的表達。在所選啟動子中，PsigX是P43強度的3.03倍[18]，但在DPE的表達中，效果較差。這些結(jié)果表明啟動子和目的基因之間存在著一定的適配性，強度大的啟動子表達效果不一定好，需要進行不斷的篩選，找出最適啟動子。

圖2 不同單啟動子重組菌株酶活力及OD600值

M-250 kDa 蛋白 Marker；1-amyE；2-aprE；3-gsiB；4-hag；5-HpaⅡ；6-nprE；7-P43；8-sigX；9-ylbP；10-對照

2.3 串聯(lián)啟動子對重組菌株表達水平的影響

選取啟動活性較高的3個啟動子Phag、PylbP和P43進行下一步研究。將這3個啟動子進行兩兩/重復(fù)串聯(lián)，通過構(gòu)建串聯(lián)啟動子介導(dǎo)的DPE重組表達菌株，研究串聯(lián)啟動子對DPE表達的影響，同時交換被串聯(lián)的兩個啟動子順序，研究啟動子的位置對DPE表達的影響，其最大酶活力及SDS-PAGE分析分別如圖4與圖5所示。大部分啟動子經(jīng)過串聯(lián)以后，酶活力反而有所降低，推測是因為所篩選的單啟動子均為啟動強度較強的啟動子，當它們被串聯(lián)時，會彼此形成干擾或競爭，反而使表達水平有所降低[19]。少部分啟動子經(jīng)過串聯(lián)以后，酶活力有了提升，如PylbP-ylbP，但其最大酶活力依然低于單啟動子Phag。同時，改變被串聯(lián)的兩個啟動子的順序，酶活力也隨之有了較明顯的改變，這說明啟動子內(nèi)部核心序列的位置，對目的基因的表達影響較大，通常而言，與目的基因相鄰的啟動子，其強度對串聯(lián)啟動子的轉(zhuǎn)錄活性影響更大[20]。此外，吳鳳依[19]構(gòu)建了串聯(lián)啟動子PP43-hag介導(dǎo)的重組菌株表達脂肪酶A，其表達效果最好，但對于本文的DPE而言，PP43-hag介導(dǎo)的重組菌株表達效果反而較差，這同樣證明啟動子和目的基因之間存在著一定的適配性。另外，與單啟動子介導(dǎo)的重組菌株相比，串聯(lián)啟動子介導(dǎo)的重組菌株在酶活力最高時，其整體OD600值的范圍要略低一些，推測是因為雙啟動子介導(dǎo)時，對重組菌株的生長造成了一定的脅迫，這也是串聯(lián)啟動子介導(dǎo)的重組菌整體酶活力較低的一個原因。

圖4 不同串聯(lián)啟動子重組菌株酶活力及OD600值

M-250 kDa 蛋白 Marker；1-hagP43；2-P43 hag；3-ylbPhag；4-hagylbP；5-ylbPP43；6-P43ylbP；7-P43P43；8-ylbPylbP；9-haghag；10-對照

以上結(jié)果同樣也表明，將兩個啟動活性較高的啟動子串聯(lián)，不一定能夠繼續(xù)增強串聯(lián)啟動子的活性。

2.4 RBS序列對重組菌株表達水平的影響

RBS序列即核糖體結(jié)合位點，決定著翻譯水平的高低，是蛋白表達的關(guān)鍵區(qū)域[21]。它位于起始密碼子AUG上游約8～13核苷酸處，是一段富含嘌呤的非翻譯區(qū)，可以與核糖體16S rRNA互補配對并與之結(jié)合，從而控制翻譯的起始。經(jīng)過篩選，發(fā)現(xiàn)單啟動子Phag介導(dǎo)的重組菌株在表達DPE時效果最好，因此以啟動子Phag的RBS序列為對象，GGAGG序列為RBS種子區(qū)域，對其前后兩個共計4個堿基進行隨機A/G突變，旨在提高目的蛋白的表達。RBS序列中具體突變序列如圖6所示，突變后的重組表達菌株酶活力及OD600值見圖7。RBS序列突變后，大多數(shù)重組菌株的酶活力得到了顯著提升，其中重組菌株B.subtilisWB800/pP43 NMK-hag-R4-dpe的酶活力最高，為25.39 U/mL，OD600值為11.65，較突變前酶活力提高了29.4%。同時，在各突變菌株酶活力最大時，其OD600值相差不大，說明突變對菌株的生長情況影響較小。

圖6 RBS序列不同突變位點

R0-原始對照菌株，R1～R15-RBS突變菌株(突變序列如圖6所示)

3 結(jié)論

本文分別構(gòu)建了9株單啟動子和9株雙啟動子介導(dǎo)的DPE表達的重組菌株，其中單啟動子Phag介導(dǎo)的重組菌株經(jīng)搖床發(fā)酵后，最大酶活力高達19.62 U/mL，是P43介導(dǎo)的原始菌株酶活力的1.3倍，是枯草芽孢桿菌常用啟動子PHpaII介導(dǎo)的重組菌株的1.77倍。然后通過RBS序列優(yōu)化，構(gòu)建了15株重組菌株，使其酶活力再次提高了29.4%，是原始菌株酶活的1.69倍，是PHpaII介導(dǎo)的重組菌株的2.29倍。綜上所述，本研究為DPE工業(yè)化生產(chǎn)提供了方法學(xué)參考，后續(xù)可對其進行發(fā)酵優(yōu)化，進一步提高其表達水平。