鹽脅迫下六妹羊肚菌菌絲體的理化性狀

楊彤，孫靜，郝宸，王建瑞，劉宇

(魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺(tái)，264000)

六妹羊肚菌(Morchellasextelata)[1]是一類重要的藥食兩用真菌，因其獨(dú)特的外觀、鮮美的口感和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值引起了世界研究者的廣泛關(guān)注。TIETEL等[2]報(bào)道羊肚菌中含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素和維生素等物質(zhì)。羊肚菌還具有各種藥用功效，如抗菌、抗氧化[3]、抗炎及提高免疫能力、抗過敏和降低血糖等。同時(shí)，研究者也一直對(duì)羊肚菌的人工栽培進(jìn)行探索，目前羊肚菌的人工栽培技術(shù)已成功實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。六妹羊肚菌是國內(nèi)現(xiàn)主栽品種之一[4-5]，前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)六妹羊肚菌菌絲具有一定的耐鹽性，所以本文對(duì)鹽脅迫下羊肚菌菌絲體多糖及其抗氧化活性進(jìn)行測定，探究多糖含量及體外抗氧化活性變化情況。

羊肚菌多糖是一類重要的真菌多糖，功效頗多，在抗腫瘤等方面具有天然的優(yōu)勢[6]。段巍鶴等[7]對(duì)小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了菌絲胞內(nèi)外多糖應(yīng)急攝入后具有明顯的抗疲勞的作用。姜浩等[8]總結(jié)了食用真菌多糖的研究進(jìn)展。目前多糖的主要提取方法有酸堿提取法[9]、酶提法[10]、水提醇沉法[11]和超聲波輔助提取法[12]，每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。羊肚菌多糖又是一類天然抗氧化劑，有關(guān)其抗氧化活性測定的報(bào)道較多，主要包括羥自由基清除能力[13]，DPPH自由基清除能力[14]以及還原力[15]等方面。但是很少有關(guān)于鹽脅迫下羊肚菌理化性質(zhì)的報(bào)道，鹽脅迫下，羊肚菌體內(nèi)的多糖結(jié)構(gòu)及物質(zhì)活性可能會(huì)發(fā)生變化，XIONG等[16]就利用γ射線輻照六妹羊肚菌子實(shí)體，研究了輻射后羊肚菌子實(shí)體多糖的結(jié)構(gòu)和抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)多糖表面出現(xiàn)斷裂和孔隙，且輻射后抗氧化活性增加。因此本文對(duì)鹽脅迫下六妹羊肚菌多糖及抗氧化活性的研究具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

六妹羊肚菌菌種為云南、四川等地主栽品種組織分離擴(kuò)繁后所得，編號(hào)M3。

1.2 主要試劑

固體PDA培養(yǎng)基(g/L)：土豆200、葡萄糖20、瓊脂16。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：土豆200、葡萄糖20。

無水葡萄糖、氯化鈉、95%乙醇、無水乙醇、氫氧化鉀、苯酚、濃硫酸、硫酸鐵、水楊酸、過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；維生素C，上海愛純生物科技有限公司；香柏油，中國上海懿洋儀器有限公司；DPPH，上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

SQP型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；OLYMPUS-BX61顯微鏡，日本奧林巴斯公司；KQ-500DE型超聲提取儀，昆山市超聲儀器有限公司；T6新悅可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Neo15R高速冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；HHS-21-6型恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DGX-9243 B-1高溫鼓風(fēng)干燥箱，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 鹽濃度的確定

將羊肚菌接種到添加NaCl的PDA培養(yǎng)基中，設(shè)定鹽濃度為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mol/L，共9個(gè)梯度。每隔12 h測量1次菌落直徑，72 h后停止并拍照保存，選擇合適的濃度。

1.4.2 菌種的培養(yǎng)與顯微觀察

將羊肚菌M3號(hào)接種到含玻璃紙的普通固體PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后將玻璃紙轉(zhuǎn)移到鹽濃度0.3 mol/L的培養(yǎng)基脅迫處理，脅迫時(shí)間分別為0、3、6、12、24、48 h。培養(yǎng)完成后每個(gè)梯度挑取4～5處菌絲尖端，在顯微鏡下觀察，每組梯度測量100根以上菌絲直徑，觀察直徑變化。羊肚菌液體菌種設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，在正常液體培養(yǎng)基中先培養(yǎng)72 h，然后對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加鹽進(jìn)行鹽脅迫處理，處理梯度為0、3、6、12、24、48 h。培養(yǎng)完成后發(fā)酵液4 ℃保存待測，菌絲球過濾并用蒸餾水沖洗2～3遍，烘箱50～60 ℃干燥，稱量菌絲體干重后粉碎成粉末，密封備用。

1.4.3 羊肚菌多糖的提取與測定

提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間梯度胞內(nèi)外多糖。胞外多糖的提取采用水提醇沉法，5 mL發(fā)酵液與20 mL 95%乙醇混合后，4 ℃醇沉24 h，醇沉后4 000 r/min離心20 min，去上清液留沉淀，沉淀中加入30 mL蒸餾水后100 ℃溶解30 min，冷卻后2 000 r/min離心20 min，上清液即為胞外多糖。胞內(nèi)多糖參考黃玲玲[17]的提取方法，料水比為1∶40(g∶mL)，超聲波功率400 W，溫度60 ℃浸提40 min，然后60 ℃熱水浸提5 h，得到浸提液。浸提液按胞外多糖提取方法處理，最后得到胞內(nèi)粗多糖溶液。取胞內(nèi)外多糖溶液2 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL濃硫酸，搖勻冷卻后在490 nm下測定吸光值，以蒸餾水作為對(duì)照，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量，如公式(1)、公式(2)所示：

參考楊懷雷等[18]的方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=11.218x-0.017 7，R2=0.999 3。

(1)

(2)

式中：c為多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品干重，g。

1.4.4 抗氧化性的測定

多糖溶液以1.4.3中3、6、12、24、48 h對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中胞內(nèi)外多糖提取液進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)。

DPPH自由基清除能力以維生素C為陽性對(duì)照，測定方法參照LEE等[19]的方法稍作調(diào)整。在試管中加入2 mL樣品液和2 mL DPPH溶液，以無水乙醇為本底將體系補(bǔ)至6 mL，混勻后迅速遮光反應(yīng)30 min，然后在517 nm下測定吸光值，以蒸餾水做對(duì)照溶液。

羥自由基清除能力測定方法參考LI等[20]的方法。在試管中加入1 mL FeSO4溶液，1 mL水楊酸-乙醇溶液和2 mL樣品液，最后加入1 mL H2O2溶液，迅速混勻后靜置30 min，然后在510 nm下測定吸光度值。本底為蒸餾水，以蒸餾水做對(duì)照溶液，維生素C為陽性對(duì)照,清除率計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光值，Aa為樣品液的吸光值，Ab為樣品本底吸光值。

1.4.5 還原力的測定

采用鐵氰化鉀還原的方法[21]并簡化。在試管中依次加入1 mL樣品液，2 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液和2 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后50 ℃水浴30 min，冷卻后加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液。有沉淀產(chǎn)生需5 000 r/min離心10 min，取上清液，無沉淀則直接吸取2 mL反應(yīng)液到試管中，加入2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻后遮光反應(yīng)30 min，在700 nm下測定吸光值。吸光值越高，證明還原能力越強(qiáng)。以維生素C為陽性對(duì)照。

1.4.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，重復(fù)3次，用WPS 2019軟件統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS 19.0軟件，利用字母標(biāo)記法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽濃度菌絲生長情況

從不同鹽濃度梯度下羊肚菌菌絲生長狀況看，隨著鹽濃度的增加，羊肚菌菌絲的生長速度被抑制，鹽濃度越大菌絲生長越緩慢(圖1，圖2)。0.05 mol/L菌絲長速和長勢與正常培養(yǎng)菌絲相比無明顯變化，菌絲潔白濃密且粗壯。0.1～0.3 mol/L 5組濃度菌絲長勢較強(qiáng)，但生長速度與濃度呈反比。0.35、0.4 mol/L濃度下菌絲稀疏，長勢較弱。根據(jù)72 h時(shí)菌落直徑繪制表1，據(jù)表1中差異顯著性來看，除0.25 mol/L和0.3 mol/L兩組梯度之間無顯著差異，其他每組鹽濃度梯度之間都呈極顯著差異(P<0.01)，且這兩組鹽濃度菌落直徑約為正常生長的1/2。綜合考慮，最終選擇0.3 mol/L作為接下來的實(shí)驗(yàn)鹽濃度。

圖1 不同鹽濃度下的菌絲生長勢

圖2 不同鹽濃度菌絲生長速度

表1 第72 h菌落直徑差異顯著性

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間菌絲顯微形態(tài)

由圖3可知，羊肚菌菌絲隨鹽脅迫時(shí)間的增加，菌絲形態(tài)無明顯變化，排列疏松無規(guī)律，未產(chǎn)生菌絲扭結(jié)等現(xiàn)象，直徑變化十分細(xì)微。根據(jù)菌絲直徑數(shù)據(jù)可得出隨著脅迫時(shí)間的增加，菌絲直徑慢慢減小(圖4)，0 h和3 h菌絲變化無顯著差異，到48 h菌絲直徑與其他組別相比則呈顯著差異性(P<0.05)。顯然脅迫時(shí)間長短對(duì)菌絲直徑具有一定影響，可能是菌絲外部為高滲環(huán)境，菌絲細(xì)胞失水縮小，所以脅迫時(shí)間越長，菌絲直徑越小。

圖3 0.3 mol/L鹽濃度脅迫不同時(shí)間菌絲形態(tài)圖(×1 000)

圖4 0.3 mol/L鹽濃度脅迫不同時(shí)間后放大1 000倍菌絲直徑圖

2.3 胞內(nèi)外多糖含量測定及菌絲體干重對(duì)比

由圖5可知，鹽脅迫后胞內(nèi)多糖含量普遍低于正常環(huán)境中胞內(nèi)多糖含量。對(duì)照組胞內(nèi)多糖含量變化顯著，可能是由于羊肚菌液體菌種生長周期為7 d左右，生長3 d后開始產(chǎn)生色素，對(duì)多糖的形成產(chǎn)生影響。到培養(yǎng)中后期培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分減少，但菌絲質(zhì)量一直增加，所以使菌絲胞內(nèi)多糖減少。在3 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組胞內(nèi)多糖含量高于對(duì)照組，為12.74 mg/g。由于羊肚菌菌絲剛處于逆境環(huán)境下，菌絲釋放多糖等營養(yǎng)物質(zhì)來抵御逆境，含量增加，隨后一部分作為有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)降低滲透勢而緩解鹽脅迫，另一部分作為生長所需營養(yǎng)物質(zhì)，所以多糖含量顯著下降。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組胞外多糖先增加后減少，12 h時(shí)含量最高，分別為0.29 mg/mL和0.14 mg/mL，實(shí)驗(yàn)組多糖總體含量遠(yuǎn)低于對(duì)照組多糖含量(圖6)。

圖5 胞內(nèi)多糖含量

圖6 胞外多糖含量

由圖7可知，隨脅迫時(shí)間的增加，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組菌絲干重都呈上升趨勢。但在脅迫3 h和6 h時(shí)，羊肚菌菌絲剛受到脅迫，菌絲干重增加，略高于對(duì)照組菌絲干重，多糖含量增加可能也與此有關(guān)。12 h之后，對(duì)照組菌絲干重的增長趨勢則高于實(shí)驗(yàn)組干重增長趨勢，鹽脅迫對(duì)菌絲開始出現(xiàn)抑制作用。

圖7 菌絲干重

2.4 抗氧化活性的研究

所有結(jié)果中維生素C質(zhì)量濃度均為0.3 mg/mL，維生素C對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組為兩次重復(fù)試驗(yàn)，主要作為對(duì)照進(jìn)行參考。

2.4.1 胞內(nèi)外多糖對(duì)DPPH自由基的清除率

由圖8可知，維生素C具有很高的DPPH自由基清除效率，與之相比羊肚菌胞內(nèi)多糖清除效率較低，但也具有一定的清除能力。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組清除率變化趨勢明顯，對(duì)照組清除率分別為10.3%、15.6%、12%、11.5%和17.1%，實(shí)驗(yàn)組清除率分別為35.8%、34.3%、33.6%、31.2%和34.3%。圖9為羊肚菌胞外多糖對(duì)DPPH自由基的清除率對(duì)比圖，對(duì)照組清除率分別為5.8%、3.6%、7.1%、4.2%和9.2%，實(shí)驗(yàn)組為24.9%、24.2%、23.6%、23.5%和24.8%。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組胞內(nèi)外多糖對(duì)DPPH自由基的清除率明顯高于對(duì)照組，胞內(nèi)多糖清除能力最高提升了3.47倍，胞外多糖清除能力最高提升了6.72倍。由此，可知鹽脅迫增加了多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力。而據(jù)2.3中胞內(nèi)外多糖含量變化來看，多糖對(duì)于清除率總體趨勢無明顯影響。

圖8 胞內(nèi)多糖的DPPH自由基清除率

圖9 胞外多糖的DPPH自由基清除率

2.4.2 胞內(nèi)外多糖對(duì)羥自由基的清除率

由圖10可知，胞內(nèi)多糖對(duì)羥自由基的清除率分別為，對(duì)照組3.6%、1.9%、3.1%、1%和0.4%，實(shí)驗(yàn)組16.9%、15.1%、27.5%、11.9%和11.1%。圖11為胞外多糖羥自由基清除率對(duì)比圖，對(duì)照組清除率分別為2.2%、2.8%、4.6%、3%和2.8%，實(shí)驗(yàn)組清除率分別為5.5%、7.7%、8.5%、7.9%和7.5%。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組胞內(nèi)多糖清除羥自由基的能力遠(yuǎn)高于對(duì)照組，在12 h時(shí)清除率最高，為27.5%。胞外多糖中實(shí)驗(yàn)組清除羥自由基能力也高于對(duì)照組，清除率最高提升了2.75倍。說明鹽脅迫也促進(jìn)了多糖對(duì)羥自由基的清除能力。由2.3中胞內(nèi)外多糖含量變化來看，胞內(nèi)外多糖的清除率大致也呈先上升后下降的趨勢，

圖10 胞內(nèi)多糖的羥自由基清除率

圖11 胞外多糖的羥自由基清除率

2.5 還原力的測定

抗氧化劑能將鐵氰化鉀還原，利用亞鐵離子生成普魯士藍(lán)，普魯士藍(lán)在700 nm處有最大吸收峰，所以吸光值越高，說明還原能力越強(qiáng)。由圖12可知，鹽脅迫下，胞內(nèi)多糖的還原力明顯降低。胞外多糖還原力先升后降再上升，6 h和48 h為上升時(shí)間點(diǎn)(圖13)。結(jié)果顯示，脅迫環(huán)境對(duì)羊肚菌胞內(nèi)多糖還原能力的影響大于對(duì)胞外多糖還原能力的影響，而多糖含量的變化趨勢對(duì)還原能力則無明顯影響。

圖12 胞內(nèi)多糖還原能力

圖13 胞外多糖還原能力

3 結(jié)論

鹽脅迫下羊肚菌菌絲生長速度減慢，菌絲直徑減小，胞內(nèi)多糖和胞外多糖呈先升后降趨勢，總體含量低于正常含量，但多糖對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除能力上升。對(duì)DPPH自由基的清除能力，胞內(nèi)多糖最高提升了3.47倍，胞外多糖最高提升了6.72倍；對(duì)羥自由基的清除能力，胞內(nèi)多糖清除率最高提升到27.5%，胞外多糖最高提升2.75倍。與冮潔等[22]測定的羊肚菌多糖不同的是，本文鹽脅迫下羊肚菌菌絲體多糖含量下降，但抗氧化性增強(qiáng)，而富硒羊肚菌菌絲體多糖含量增加且抗氧化性增強(qiáng)。還原能力上，胞內(nèi)多糖還原能力下降，胞外無明顯升高或降低，總體來說DPPH自由基清除能力>羥自由基清除能力>還原能力。本研究所提取的多糖為粗多糖，提取未純化，后期可以進(jìn)一步對(duì)提取方案進(jìn)行優(yōu)化。

目前羊肚菌的栽培多在普通耕地上進(jìn)行，鹽堿地中栽培還未有人報(bào)道，而對(duì)于其可行性已有學(xué)者進(jìn)行研究。如2020年李樹文等[23]就對(duì)耐鹽堿羊肚菌菌株進(jìn)行了篩選。鹽脅迫下羊肚菌生理活性和分子機(jī)制的研究還是一片空白，因此深度探究鹽脅迫對(duì)羊肚菌理化性質(zhì)的影響，可以對(duì)羊肚菌抗鹽育種及栽培提供一定的前期基礎(chǔ)和理論依據(jù)。