丁香精油對杧果采后炭疽病及品質(zhì)的影響

李俊國，胡美姣，弓德強，母軍霞，王偉博，高兆銀，李敏，谷會，陳千付，雷新濤*

1(海南大學 園藝學院，海南 ?？?，570228)2(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，海南 ?？?，571101)3(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，海南 ?？?，571101)4(海南省熱帶園藝產(chǎn)品采后生理與保鮮重點實驗室，海南 海口，571101)

炭疽菌是一類重要的致病真菌，主要包括膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)、博寧炭疽菌(Colletotrichumboninense)[1-3]等，分布范圍極廣，熱帶、亞熱帶甚至溫帶的植物都可能成為其寄主。多種炭疽菌屬(ColletotrichumCorda)的真菌可誘發(fā)炭疽病[4]，危害杧果、茶樹、百香果、番木瓜等[5-8]，造成嚴重的經(jīng)濟損失。杧果是著名的熱帶水果之一，作為我國重要的熱帶、亞熱帶經(jīng)濟作物，其主要的采后病害包括炭疽病、蒂腐病和果腐病等[9]。近年來，炭疽病成為危害杧果的采前生長期和采后貯藏階段最嚴重的病害之一[10]，嚴重時甚至造成絕產(chǎn)[11]。該病最初在杧果皮上潛伏，直到果實發(fā)育的最后階段發(fā)病導致果實腐爛[12]。生產(chǎn)上對杧果果實采后炭疽病的防治多是使用化學殺菌劑，高效但極易出現(xiàn)殘留，會損傷果實質(zhì)量和危害人體健康，因此，開發(fā)高效和無殘留、無毒害的抑制劑尤為重要。

植物精油是芳香植物的高度濃縮提取物，不溶于水，易溶于有機溶劑，具有揮發(fā)性，油狀液體物質(zhì)[13]，大多具有還原性、抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑，同時具有安全環(huán)保、低毒低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等特點，常用于鮮切水果、果蔬保鮮以及作物腐敗菌和致病菌的控制[14]。植物精油在果蔬保鮮抗病等方面取得顯著的效果，可有效抑制荔枝的褐變、腐敗[15]，多種精油對鏈格孢霉(Alternariaalternata)、指狀青霉(Penicilliumdigitatum)、灰霉(Botrytiscinerea)有較強的抑制作用[16]，芥末精油能抑制杧果炭疽菌和蒂腐病菌在杧果果實上的生長[17]。丁香精油對番茄灰霉病有較好的抑制效果，能有效抑制櫻桃番茄的自然腐爛[18]。

本試驗通過10種植物精油對杧果炭疽菌的離體抑菌效果，篩選出對杧果炭疽菌的最佳抑制精油及其濃度，探討丁香精油對杧果炭疽菌的防治和品質(zhì)的影響，以期為丁香精油對杧果炭疽菌抑制機理的深入研究及杧果炭疽病防治機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試杧果炭疽病菌(C.gloeosporioides)為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所采后病害與保鮮課題組提供。

丁香精油、肉桂精油、茶樹精油、香茅精油、樟腦精油、玫瑰草精油、草果精油、山茶花精油、橄欖精油和檸檬精油，上海源葉生物科技有限公司。

供試品種為杧果品種“貴妃杧”，購于廣西百色國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)杧果園。

1.2 儀器與設備

電子計重稱，上海英展機電企業(yè)有限公司；GY-4型果實硬度計，浙江托普儀器有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司；PAL-1型手持糖度計，日本Atago株式會社；恒溫培養(yǎng)箱，艾力特國際貿(mào)易有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 10種植物精油對杧果炭疽菌離體抑制效果測定

采用生長速率法測定。結合預試驗結果，采用含藥平板法進行植物精油對杧果炭疽菌的抑菌試驗，配制如表1中設定好的系列精油濃度的PDA培養(yǎng)基(45 mL)，倒入3個培養(yǎng)皿中，取PDA培養(yǎng)基上生長7 d的供試菌株，用直徑5 mm的無菌打孔器在其菌落邊緣均勻打孔，并將菌餅每皿1塊接入上述設定好濃度的帶藥培養(yǎng)基和不含精油對照培養(yǎng)基中心，每個處理3次重復，置于28 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照組病原菌生長至第7天，采用十字交叉法，測量菌落直徑，計算抑菌率，并查出對應的抑菌幾率值。以濃度對數(shù)(X)為橫坐標，抑制幾率值(Y)為縱坐標，計算回歸方程Y=a+bX和相關系數(shù)(r)，并由回歸方程計算抑制菌落擴展的有效濃度EC50值和EC90。菌落生長抑制率按公式(1)計算：

表1 植物精油設定濃度

抑菌率/%

(1)

1.3.2 丁香精油對貴妃杧刺傷接種后發(fā)病的影響

選取大小基本一致，無機械損傷，果皮表面光滑的貴妃杧，結合體外抑制結果，配制0.2、0.5、1.0、2.0 和4.0 μL/mL的丁香精油溶液，每個濃度9個果實，用5 mm打孔器在果面上均勻打6個孔，然后放入配制好的精油溶液中浸泡5 min，取出晾干，然后分別接入5 mm杧果炭疽菌菌餅，置于保鮮盒中，室溫貯藏，每3 d統(tǒng)計1次病斑直徑和發(fā)病指數(shù)，病斑直徑用直尺十字交叉法測定2次，取平均值。

參照覃麗萍等[19]的病情分級標準：0級，無病癥；1級，d(病斑直徑)<5 mm；2級，5 mm40 mm。病情指數(shù)計算如公式(2)所示:

病情指數(shù)

(2)

1.3.3 丁香精油對貴妃杧自然發(fā)病的影響

每個處理20個果，3次重復，然后放入配制好的2.0 μL/mL丁香精油溶液中浸泡5 min，以清水浸泡為對照，取出自然晾干，每3 d觀察1次，統(tǒng)計自然發(fā)病個數(shù)及發(fā)病等級，計算發(fā)病指數(shù)和防效，如公式(3)和公式(4)所示。參照弓德強等[20]的方法，將病情按輕重分為5級：0級，無病斑；1級，出現(xiàn)零星腐爛斑點；2級，病斑面積占果實總面積的 25%以下；3級，病斑面積占果實總面積的25%～50%；4級，病斑面積占果實總面積的50%以上。

(3)

(4)

1.3.4 丁香精油對貴妃杧采后品質(zhì)的影響

選取大小基本一致，無機械損傷，果皮表面光滑的貴妃杧，然后放入2.0 μL/mL丁香精油溶液中浸泡5 min，以清水浸泡為對照，取出自然晾干，然后放入保鮮盒內(nèi)，每個處理10個果，3次重復，每隔3 d取樣。

質(zhì)量損失率直接采用稱量法；硬度采用硬度計進行測定；可溶性固形物采用手持糖度計測定；可滴定酸用糖酸測定器測定；維生素C含量采用液相色譜測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用SPSS 18.0軟件進行方差分析，Duncan法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 丁香精油對杧果炭疽病原菌生長的影響

10種植物精油對杧果炭疽菌均具有抑制效果，如表2 所示。從EC50值來看，丁香精油、肉桂精油、茶樹精油、香茅精油和樟腦精油可歸為一類，EC50值均小于1.0 μL/mL 抑菌效果較強；其次為玫瑰草油和橄欖精油，草果精油、山茶花精油和檸檬精油EC50值大于1.0 μL/mL，其中抑菌效果最弱為草果精油、山茶花精油和檸檬精油，EC50值均大于2.0 μL/mL；從EC90值來看，丁香精油歸為一類，EC90值為0.565 μL/mL，肉桂精油、茶樹精油和樟腦精油歸為一類，EC90值均小于10.0 μL/mL，最后是香茅精油、玫瑰草油、橄欖精油、草果精油、山茶花精油和檸檬精油，EC90值均大于10.0 μL/mL?？傮w來看，丁香精油的抑菌效果最強，EC50值和EC90值分別為0.194 μL/mL和0.565 μL/mL。

表2 植物精油對杧果炭疽菌菌落生長抑制效果

2.2 丁香精油對貴妃杧刺傷接種后發(fā)病的影響

丁香精油在杧果進行刺傷接種試驗結果表明，在貯藏期間，接種了杧果炭疽菌的貴妃果實，病斑直徑不斷擴大，不同濃度的丁香精油對杧果炭疽菌均有不同程度的抑制作用(表3、表4)。3 d時，1.0、2.0、4.0 μL/mL處理病斑直徑和病情指數(shù)與對照有顯著性差異(P<0.05)；6 d和9 d時，各處理均能顯著抑制病斑直徑擴展(P<0.05)；但9 d時，僅有1.0 μL/mL和2.0 μL/mL處理病情指數(shù)與對照有顯著性差異(P<0.05)；12 d時，各處理均能顯著性抑制杧果炭疽菌病斑擴展(P<0.05)，0.5、1.0、2.0 μL/mL處理組病情指數(shù)與對照組有顯著性差異(P<0.05)?？傮w來看，2.0 μL/mL丁香精油處理效果最好，病斑直徑僅為10.45 cm，病情指數(shù)為46.25，與其他處理有顯著性差異(P<0.05)。由此可知，2.0 μL/mL丁香精油的處理效果最好，可有效抑制炭疽病害直徑擴展。

表3 丁香精油對貴妃杧炭疽病病斑直徑的影響

表4 丁香精油對貴妃杧炭疽病病情指數(shù)的影響

綜合丁香精油對杧果炭疽病病斑直徑和病情指數(shù)的影響，篩選出2.0 μL/mL為丁香精油最適處理濃度，并將其應用于貴妃杧采后品質(zhì)試驗。

2.3 丁香精油對貴妃杧自然發(fā)病的影響

貴妃杧在常溫下貯藏，清水浸泡對照發(fā)病情況最嚴重，丁香精油處理和清水處理在病情指數(shù)上出現(xiàn)差異顯著(表5)，在防效上，2.0 μL/mL丁香精油處理能夠有效地防止貴妃杧采后自然病害的發(fā)生，能延長果實貨架期。貯藏第9天時，貴妃杧開始自然發(fā)病，2.0 μL/mL 處理和對照病情指數(shù)達到顯著差異水平，防效為54.59%；12 d時，2.0 μL/mL的防效下降至52.63%，下降幅度較緩，且病情指數(shù)差異顯著；說明2.0 μL/mL處理對貴妃杧采后貯藏前期預防自然發(fā)病防治效果較好，貯藏后期出現(xiàn)自然發(fā)病現(xiàn)象后，防治效果減弱。

表5 丁香精油對貴妃杧采后炭疽病的影響

2.4 丁香精油對貴妃杧采后品質(zhì)的影響

2.4.1 丁香精油對貴妃杧失重率的影響

隨著貯藏時間的延長，處理和對照的失重率均逐漸變大，具體如圖1所示。貴妃杧在整個貯藏期間，失重率逐漸增大，其中對照貴妃杧失重率最高，貯藏12 d 時貴妃杧的失重率為3.38%，而2.0 μL/mL處理的失重率僅為0.68%。從貯藏第6天開始，對照出現(xiàn)質(zhì)量損失，而丁香精油2.0 μL/mL處理還未出現(xiàn)，且后面的貯藏期間失重率都顯著低于對照(P<0.05)，說明丁香精油2.0 μL/mL處理可明顯降低貴妃果實貯藏后期果實失重率的上升速度，從而達到抑制失重的效果。

圖1 貴妃杧失重率的變化

2.4.2 丁香精油對貴妃杧果實硬度的影響

丁香精油處理貴妃果實的硬度隨貯藏時間的延長呈先上升后下降的趨勢，對照呈下降趨勢，如圖2所示。2.0 μL/mL處理貯藏第3天時，其硬度出現(xiàn)上升，其硬度為21.35 kg/cm2，與對照出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)；在貯藏第6天時，2.0 μL/mL處理與對照達到差異顯著水平(P<0.05)；在貯藏第9天時，對照與2.0 μL/mL處理硬度下降幅度變大，硬度分別為8.93 kg/cm2和，差異不顯著(P>0.05)；貯藏12 d時，2.0 μL/mL處理出現(xiàn)硬度大幅度下降，其硬度為1.76 kg/cm2，與對照沒有出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)；從整個貯藏階段來看，2.0 μL/mL處理的硬度變化比對照的小，在貯藏過程中與對照保持有較大的硬度差異。

圖2 貴妃杧果實硬度的變化

2.4.3 丁香精油對貴妃杧TSS含量的影響

丁香精油處理對貴妃杧果實的可溶性固形物的影響如圖3所示，2.0 μL/mL處理和對照的可溶性固形物含量在貯藏期間總體呈上升趨勢。在貯藏第3天前，處理和對照可溶性固形物含量輕微下降，在貯藏時間為3～6 d時，處理和對照可溶性固形物含量呈上升趨勢，且差異不顯著(P>0.05),在第12天時，處理和對照可溶性固形物含量持續(xù)上升，且2.0 μL/mL 處理與對照出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，可溶性固形物含量分別為13.52%、12.46%，結果表明貴妃杧貯藏過程中丁香精油處理的濃度對可溶性固形物含量的影響并不大，保持了貴妃杧正常的甜度變化。

圖3 貴妃杧可溶性固形物含量的變化

2.4.4 丁香精油對貴妃杧可滴定酸含量的影響

貴妃杧采后貯藏期間，丁香精油處理和對照的可滴定酸含量呈下降趨勢如圖4所示。在貯藏前6 d，對照的可滴定酸含量高于2.0 μL/mL處理，含量分別為2.28%和2.20%，含量間無顯著差異(P>0.05)；貯藏6～12 d，2.0 μL/mL處理的可滴定酸含量高于對照，但差異不顯著(P>0.05)。

圖4 貴妃杧可滴定酸含量的變化

2.4.5 丁香精油對貴妃杧維生素C含量的影響

如圖5所示，丁香精油處理和對照貴妃杧果實的維生素C含量均隨著貯藏時間的延長而降低，貯藏3 d時，2.0 μL/mL處理和對照維生素C含量下降最快，2.0 μL/mL處理維生素C含量為6.82 mg/100g，對照含量為4.80 mg/100g，差異顯著(P<0.05)。貯藏6 d時，對照維生素C含量下降幅度較緩，為4.68 mg/100g，而2.0 μL/mL處理持續(xù)下降，維生素C含量為5.23 mg/100g，差異不顯著(P>0.05)。貯藏9 d時，2.0 μL/mL處理和對照差異顯著(P<0.05)。貯藏12 d時，2.0 μL/mL處理和對照維生素C含量分別為3.52和3.56 mg/100g，差異不顯著(P>0.05)?？傮w來看，2.0 μL/mL處理的維生素C含量高于對照，說明濃度為2.0 μL/mL的丁香精油處理后，有效延緩了貴妃杧果實維生素C含量的下降，有效維持了貴妃杧果實的新鮮度。

圖5 貴妃杧維生素C含量的變化

3 討論與結論

丁香精油對很多果蔬致病菌具有廣譜抑制作用。王丹等[21]發(fā)現(xiàn)丁香精油在0.40～0.80 μL/mL可有效抑制灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、鏈格孢菌(A.alternata)和膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的菌絲體生長。本試驗測定10種植物精油對杧果炭疽菌(C.gloeosporioides)的菌絲體生長抑制作用，篩選出丁香精油抑制效果最好，與王丹等[21]結果一致，說明丁香精油具有抑制貴妃杧采后炭疽病的潛力。

丁香精油作為一種天然保鮮劑，對果蔬采后保鮮具有一定的增效作用。李寧等[22]研究發(fā)現(xiàn)丁香精油對圣女果具有較強的防腐效果，5.0 μL/mL丁香精油能顯著抑制圣女果軟腐病，提高好果率。李鵬霞等[23]發(fā)現(xiàn)丁香精油能夠抑制蘋果采后病害發(fā)生，減緩硬度下降的速度，并且能有效保持蘋果的可滴定酸含量，有利于保持蘋果的品質(zhì)和風味；李寧等[24]發(fā)現(xiàn)0.50%丁香精油處理有助于抑制冬棗采后腐爛，提高抗病性，還具有較好的保鮮效果，保持冬棗品質(zhì)；黃巍等[25]研究發(fā)現(xiàn)，貯藏期間0.60%丁香精油可有效抑制水蜜桃失重，并且有利于維持水蜜桃的可溶性固形物和維生素C含量。本試驗結果表明2.0 μL/mL丁香精油處理能有效抑制貴妃杧刺傷接種后病情指數(shù)和自然發(fā)病病情指數(shù)；說明2.0 μL/mL丁香精油對杧果采后炭疽病具有良好的抑制效果；同時可明顯抑制貴妃杧果實失重，減緩果實硬度下降，并且有效維持果實可滴定酸和維生素C含量，貯藏后期有較高的可溶性固形物含量。

綜上所述，丁香精油對杧果炭疽菌(C.gloeosporioides)具有良好的抑制效果，能夠作為殺菌劑應用于杧果采后病害防控，并且在一定濃度處理下，能有效維持杧果采后品質(zhì)和風味。

植物精油對果蔬采后保鮮的研究報道越來越多，傳統(tǒng)精油處理技術主要為精油浸泡法、噴灑法和熏蒸法，但在實際生產(chǎn)過程中的應用存在一些問題：(1)精油處理果實后，揮發(fā)性物質(zhì)在果實表面殘留，影響果實本身的風味；(2)在精油處理過程中，精油濃度過高或處理不當，會對果實造成藥害。因此更高效的精油處理技術有待深入研究，如丁香油-殼聚糖復合抑菌劑、精油微膠囊化和抑菌紙法等，從而有利于在果蔬貯藏、運輸和銷售過程中控制質(zhì)量安全，防止品質(zhì)劣變。隨著精油處理技術不斷發(fā)展，植物精油開發(fā)利用的前景會越來越廣闊。