Bacillus circulans來源β-半乳糖苷酶在Bacillus subtilis中的表達、性質及發酵優化

許俊勇，畢然，夏偉*，陳晟*

1(江南大學,食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)3(江南大學,教育部食品安全國際合作聯合實驗室，江蘇 無錫，214122)

隨著社會的進步，人們的生活水平越來越高，人們越發注重身體保健，社會上要求發展功能性食品的呼聲越來越強烈[1]。低聚半乳糖(galactooligosaccharide，GOS)便是功能性食品中一種具有天然屬性的功能性低聚糖[2]。GOS通常情況下是以D-葡萄糖為還原端殘基，再連接2～8個半乳糖的寡糖，某些情況下它的還原端也可為半乳糖[3]。GOS在高溫以及低pH下的高穩定性讓它具有在食品工業中應用的價值[4]，并且為了模擬母乳中的人乳寡糖(human milk oligosaccharides，HMOs)的作用，GOS是目前商業嬰兒奶粉中首選的益生元添加劑[5]。

由于GOS具有優秀的理化性質和生理性能，國內外有較多學者對GOS展開研究。目前制備GOS方法主要有：從自然界中提取、天然高聚糖的水解、化學合成法、酶法合成等[6-7]?，F有商業化GOS主要是利用β-半乳糖苷酶催化轉糖基反應進行酶法制備，FRENZEL等[8]對幾種不同來源的商品化β-半乳糖苷酶制備GOS進行了比較，發現來自環狀芽孢桿菌的商品酶轉化率最高，在40%的底物濃度下轉化率可達41%。為了提高轉化率，很多學者對現有的酶進行改造，WU等[9]對Sulfolobussolfataricus來源的β-半乳糖苷酶進行改造后，轉化率可達61.7%。但是目前β-半乳糖苷酶多在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達，同時商品化酶轉化率低等原因限制了該酶在食品工業中的應用。

由于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)與其他的微生物相比具有優秀的蛋白質分泌能力[10]，可以在十分廉價的培養基上生長，并且在工業發酵過程中有著很好的穩定性[11]，已被廣泛應用于與食品加工相關蛋白的重組表達[12]。對目前常用的發酵宿主E.coli來說，B.subtilis是非致病的[12]，同時它還具有十分明確的遺傳背景，完善的基因操作工具，這些都使它作為食品代謝工程宿主具有相當強的吸引力[13]。

本研究首次將來自環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)的β-半乳糖苷酶基因β-Gal-Ⅱ[14]在B.subtilis中進行了異源表達，對重組β-半乳糖苷酶進行了酶學性質表征，同時對其制備GOS的能力進行了研究。鑒于該酶具有優秀的GOS制備能力，為了提高該酶的表達水平以降低工業化生產的成本，對重組菌的搖瓶發酵條件進行了優化，并按照優化后的條件成功進行了3-L罐的放大培養及發酵。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質粒與菌株

E.coliJM109為本實驗室保藏，B.subtilisWS9為本實驗室構建及保藏，載體pHY300PLK為本實驗室構建及保藏[15]。pHY300PLK是一種穿梭質粒，其上有兩個復制原點，可以在E.coli和B.subtilis兩種菌體內進行克隆，在E.coli體內表現為氨芐抗性，在B.subtilis體內表現為四環素抗性，同時它在B.subtilis中是一種組成型表達載體。

1.1.2 培養基及培養條件

1.1.2.1 培養基

LB液體培養基(g/L)： NaCl 10，酵母粉 5，蛋白胨 10。

LB固體培養基：含有20 g/L瓊脂粉的LB液體培養基。

TB液體培養基(g/L)：甘油 5，蛋白胨12 ，酵母粉24 ， KH2PO42.31 ， K2HPO412.54 。

搖瓶優化后的培養基(g/L)：甘油5，玉米漿干粉7.5， 安琪酵母粉7.5， KH2PO42.31， K2HPO412.54。

3-L罐發酵基礎培養基(g/L)： 安琪酵母粉7.5， 玉米漿干粉7.5， 葡萄糖5，MgSO4·7H2O 1， (NH4)2-H-citrate 1，(NH4)2SO42.68， Na2SO32， NaH2PO4·H2O 4， K2HPO414.6，微量元素溶液3 mL。

3-L罐發酵補料培養基(g/L)： 安琪酵母粉50， 玉米漿干粉50， 葡萄糖300，微量元素溶液40 mL。

微量元素溶液(g/L)： MnSO4·H2O 0.1， CoCl2·6H2O 0.18， CuSO4·5H2O 0.16， ZnSO4·7H2O 0.18,CaCl20.5， FeCl38.35， Na2-EDTA 10.05。以上培養基均在120 ℃滅菌20 min。

1.1.2.2 培養條件

搖瓶種子液培養：從保存在-80 ℃冰箱中的甘油管中，取20 μL接種到10 mL的LB中在37 ℃，200 r/min下培養8～10 h即為搖瓶種子液。

搖瓶發酵培養：將培養好的搖瓶種子液按照5%的接種量轉接到優化后的發酵培養基中，在37 ℃，200 r/min的空氣搖床中培養2 h后將溫度降至 33 ℃ 繼續培養24 h。

3-L罐種子液培養：從保存在-80 ℃的冰箱中的甘油管中，取100 μL接種到50 mL的LB中在37 ℃，200 r/min下培養8～10 h即為搖瓶種子液。

3-L罐發酵培養：取培養好的3-L罐種子液100 mL轉接到含有900 mL基礎培養基的3-L罐中，設置溫度33、37 ℃，pH 7.0，通氣量保持在1.5 L/min，維持溶氧為30%，轉速與溶氧偶聯。

1.1.3 主要試劑

質粒小提試劑盒(DP103)以及普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)，天根生物科技有限公司；SDS-PAGE試劑盒，碧云天生物技術有限公司；瓊脂糖、溶菌酶、氨芐青霉素，上海生工生物工程股份有限公司；DNA和蛋白Marker，東盛生物；其他試劑，上海國藥集團有限公司，試劑級別均是分析純，安琪酵母粉、玉米漿干粉為工業級。液相檢測標準品乳糖、異乳糖、半乳二糖，Megazyme公司；半乳糖、葡萄糖，Glycarbo公司。

1.1.4 儀器與設備

PCR儀、Mini Protein 3蛋白膠電泳儀、GelDoc-it凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；3-L全自動發酵罐、小型臺式離心機，德國Eppendorf公司；恒溫培養箱及搖床，上海知楚儀器有限公司；722型可見光分光光度計，上海市棱光儀器廠；DYY-6C型核酸膠電泳儀，北京六一電泳儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質粒的構建

根據B.subtilis密碼子偏好性，對B.circulans來源的β-半乳糖苷酶β-Gal-Ⅱ (NCBI登錄號：QJU69416.1)的編碼基因進行密碼子優化后，由無錫天霖生物有限公司合成并連接至pET-24a(+)載體，之后通過一步克隆連接的方式進行載體更換。以AATAAGGAGTGTCAAGAATGCGTCGTATTAACTTTAACGATAACTGG為上游引物F，以TTTTTATTACCAAGCTTTCAGTGATGGTGATGGTGGTGC為下游引物R對目的基因進行PCR擴增(下劃線部分為載體同源臂部分)，以AAGCTTGGTAATAAAAAAACACCTCC為上游引物F′，以TCTTGACACTCCTTATTTGATTTTTTG為下游引物R′對載體進行PCR擴增，對擴增條帶進行瓊脂糖凝膠電泳并膠回收，利用一步克隆連接酶進行連接。

將連接后的產物轉化E.coliJM109感受態細胞并涂布于帶有氨芐抗生素(100 mg/L)的LB平板，在37 ℃培養箱中培養12 h左右挑取轉化子進行菌落PCR，酶切驗證并送測序。

1.2.2 重組β-半乳糖苷酶β-Gal-Ⅱ的表達

將驗證正確的重組質粒pHY300PLK-β-Gal-Ⅱ電轉入B.subtilisWS9感受態細胞并涂布于含有四環素抗生素(30 mg/L)的LB平板，37 ℃培養箱中培養10～12 h 后挑取3～5個轉化子進行質粒提取并酶切驗證，將驗證成功后的轉化子進行搖瓶發酵24 h后測定發酵上清液及破壁上清液的酶活，同時進行SDS-PAGE分析。

1.2.3oNPG水解酶活力測定

取一定稀釋倍數的酶液100 μL，加入1.8 mL的pH為5.0的磷酸氫二鉀-磷酸二氫鈉緩沖液(50 mmol/L，下同)中，并于50 ℃水浴鍋中保溫5 min后加入100 μL的底物鄰硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷(2-nitrophenyl beta-D-galactopyranoside，oNPG)(20 mmol/L)，準確反應10 min后加入1 mL的Na2CO3(1 mol/L)終止反應并顯色，在420 nm處測定溶液吸光值，在上述實驗條件下，β-半乳糖苷酶每分鐘催化oNPG分解產生1 μmoloNP所需的酶量定義為1個活力單位。

1.2.4 最適pH、溫度及pH、溫度穩定性

為檢測重組β-半乳糖苷酶的最適pH及溫度，首先在50 ℃下檢測不同pH(3.0～9.0)的酶活力，以最高酶活力為100%，計算各pH下的相對活力。在尋找到最適pH后，在該pH下檢測不同溫度(30～70 ℃)的酶活力，同樣以最高酶活力為100%，計算各溫度下的相對活力。

為檢測重組β-半乳糖苷酶的pH及溫度穩定性，將酶液置于一定pH梯度(3.0～7.0)的緩沖液中并在4 ℃下靜置，每隔一段時間取樣測量其殘余酶活力，以初始酶活力為100%，計算各取樣時間下的相對活力。為測量其溫度穩定性，將酶液置于一定溫度梯度(40～60 ℃)的水浴鍋中，每隔一段時間取樣測量其殘余酶活力，以初始酶活力為100%，計算各取樣時間下的相對活力。

1.2.5 搖瓶發酵優化

為滿足工業化生產應用，對重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ搖瓶發酵進行發酵優化，首先選取11種氮源替代TB中的蛋白胨及酵母粉，進行氮源種類優化，分別為：酵母浸膏、魚粉蛋白胨、牛肉蛋白胨、棉籽粉、牛肉浸膏、玉米漿干粉、大豆蛋白胨、豬骨蛋白胨、牛肉粉、安琪酵母粉、豆粕粉；優化后選取較好的4種氮源進行氮源濃度優化；再根據優化結果選取2種氮源進行復合氮源的濃度及配比優化，最終確定重組β-半乳糖苷酶的搖瓶發酵最佳復合氮源及其配比，每種優化結果均以酶活力測定及SDS-PAGE分析來確定。

1.2.6 3-L罐放大培養及優化

3-L罐的初始裝液量為900 mL，基礎培養基及初始參數設置見1.1.2.2培養條件。接種量為100 mL種子液，待溶氧反彈后開始補料，之后每隔4 h取1次樣，測定菌體的OD600值及酶活力。同時在3-L罐上進行發酵溫度的優化，除設置33、37 ℃兩個發酵溫度外，其余所有參數均一致。

1.2.7 制備GOS的研究

以pH 5.0的磷酸緩沖液溶解乳糖制成質量濃度為400 g/L的底物，取10 mL底物于50 mL離心管中并置于水浴搖床(設置參數：50 ℃、150 r/min)中溫育10 min，加入酶液至終體系中酶活力為 5 U/mL，反應8 h左右。酶轉化產物通過沸水浴10 min后12 000 r/min離心2 min去除蛋白，取上清液稀釋20倍后通過HPLC檢測并計算轉化率。

1.2.8 低聚半乳糖含量的檢測

二糖的檢測：Agilent 1200 HPLC色譜儀，Agilent自動進樣器，色譜柱Thermo Aps-2 HYPERSIL (4.6 mm×250 mm)，示差檢測器Agilent 2410；流動相為80%(體積分數)乙腈/水溶液，流速和柱溫分別設置為0.8 mL/min和35 ℃。

低聚半乳糖中的三糖、四糖、五糖以及乳糖和單糖的檢測：Agilent 1200 HPLC色譜儀，Agilent自動進樣器，色譜柱Hi-Plex Ca(300 mm×7.7 mm)，示差檢測器Agilent 2410；流動相為純水，流速和柱溫分別為0.5 mL/min和80 ℃。

GOS產率的計算如公式(1)所示[16]：

(1)

式中：低聚半乳糖為異乳糖、半乳二糖、低聚半乳糖三糖、低聚半乳糖四糖等更高聚合度的寡糖。

2 結果與分析

2.1 重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ的表達

將構建好的重組載體pHY300PLK-β-Gal-Ⅱ轉入到B.subtilisWS9中，獲得重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ。經搖瓶發酵24 h后，測得重組菌的OD600值為7.72，取648 μL的菌體進行離心并用1 mL磷酸緩沖液進行復溶后破壁，離心獲得破壁上清液及破壁沉淀。將重組菌的發酵上清液、破壁上清液、破壁沉淀進行SDS-PAGE分析后發現，在發酵上清液、破壁上清液的91.5 kDa(β-Gal-Ⅱ的理論蛋白分子質量)處均有明顯的蛋白條帶(圖1)，表明β-半乳糖苷酶在B.subtilisWS9中可以正常表達，且在無信號肽的情況下可以分泌至胞外，這可能是通過BENDTSEN等[17]的研究中提到的B.subtilis中存在的一種非典型分泌途徑進行分泌的。測得發酵上清液和破壁上清液的酶活力分別為1.98、1.65 U/mL。

M-蛋白質Marker；1-發酵上清液；2-破壁上清液；3-破壁沉淀

2.2 重組β-半乳糖苷酶β-Gal-Ⅱ酶學性質

在不同pH、溫度下測定重組β-半乳糖苷酶β-Gal-Ⅱ 粗酶液的酶活力以獲得其最適pH、溫度及pH、溫度穩定性，結果如圖2所示。重組β-半乳糖苷酶的最適pH為5.0，當pH低于5.0時酶活力急劇下降，在pH 5.0～9.0酶活力變化較小。重組β-半乳糖苷酶的酶活力隨溫度的升高呈現出先上升后下降的趨勢，在60℃達到酶活力最高點，當溫度上升到70 ℃時，酶活力幾乎完全喪失，可能是由于高溫破壞了蛋白結構導致其失活。當pH在5.0～7.0，該酶具有很好的pH穩定性，放置24 h后的酶活力依舊可以保持在95%以上，而在pH 3.0和pH 4.0的條件下，該酶很快失活，3 h 降至初始酶活力的30%和50%左右。該酶在 40 ℃ 下具有很好的熱穩定性，放置24 h后依舊能保持95%以上的活性，在50 ℃下，3 h左右酶活力降至初始酶活力的53.4%，而在60 ℃下，30 min幾乎喪失所有酶活力(圖2中未體現)，僅剩初始酶活力的2.35%。

a-pH對重組β-Gal-Ⅱ酶活力的影響；b-溫度對重組β-Gal-Ⅱ酶活力的影響；c-重組β-Gal-Ⅱ的pH穩定性；d-重組β-Gal-Ⅱ的熱穩定性

2.3 重組β-半乳糖苷酶制備GOS

不同來源的β-半乳糖苷酶制備GOS的能力往往有著較大的差異，何乃瑩等[18]對一些不同來源的β-半乳糖苷酶制備GOS的條件及轉化率進行了整理，多數野生型酶及突變體的轉化率低于50%，轉化率低一直是亟待解決的問題。我們對該重組β-半乳糖苷酶進行了GOS制備的研究，在底物乳糖質量濃度為40 g/L的條件下，研究了不同溫度對該酶制備GOS的影響，結果如圖3所示，在50 ℃下反應8 h轉化率最高可達60.32%，隨著溫度的升高可以更早的達到轉化率的最大值，但高于50 ℃后最高轉化率略有降低，可能是由于高溫使得酶有一部分失活從而導致轉化率偏低。

a-氨基柱(黑色)：1-葡萄糖；2-轉移二糖；3-乳糖；4-異乳糖；鈣柱(紅色)：1-四糖；2-三糖；3-二糖；4-葡萄糖；5-半乳糖；b-不同溫度下的β-半乳糖苷酶總轉化率隨時間的變化

2.4 重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ搖瓶發酵優化

該重組β-半乳糖苷酶的最高轉化率可達60%左右，高于很多商品酶，且反應時間較短僅需要8 h左右即可達到轉化率的最高點，具有很好的工業化應用前景。但目前的該酶催化制備GOS加酶量為5 U/mL，而TB搖瓶發酵酶活力僅為4.55 U/mL，且該培養基成本過高，所以為了提高重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ的表達水平，以進一步降低工業化應用的用酶成本，需要對發酵培養基進行優化以提高表達水平。

本研究主要針對發酵培養基的氮源種類、濃度及復合氮源濃度及配比進行優化，尋找最佳發酵氮源。鑒于搖瓶發酵具有周期短，便于操作等優點，首先在搖瓶中選用了11中不同的氮源替換TB中的酵母粉及蛋白胨，在相同條件下培養24 h后通過檢測發酵上清液、破壁上清液的酶活力以及SDS-PAGE分析不同氮源對產酶的影響，結果如圖4-a、圖4-d、圖4-g所示。魚粉蛋白胨、牛肉浸膏、玉米漿干粉、安琪酵母粉是較好的4種氮源，故選取這4種氮源繼續進行氮源濃度的優化。在氮源總質量濃度為20、28、36、40 g/L的梯度下進行，結果如圖4-b、圖4-e、圖4-h所示。由于玉米漿干粉高濃度時在培養基中不能完全溶解，存在大量沉淀，對OD600值的檢測具有較大的影響，故玉米漿干粉單獨做氮源未檢測破壁上清液的酶活力。結果顯示，牛肉浸膏、安琪酵母粉、玉米漿干粉質量濃度分別為28、20、28 g/L時有利于β-半乳糖苷酶的表達，但由于牛肉浸膏價格昂貴，考慮工業化生產的成本問題，后續繼續選擇安琪酵母粉和玉米漿干粉進行復合氮源的濃度及配比優化，結果如圖4-c、圖4-f、圖4-i所示。在嘗試了不同濃度的配比之后發現，當安琪酵母粉和玉米漿干粉均為7.5 g/L時，最有利于β-半乳糖苷酶的表達，此時的搖瓶總酶活力最高，可達6.82 U/mL，是TB發酵的1.5倍，單一氮源發酵的2～2.5倍。

M-蛋白質Marker；a、d、g-TB及11種氮源的搖瓶發酵結果(泳道1～12與a圖中橫坐標一一對應)；b、e、h-4種氮源不同濃度的搖瓶發酵結果(e中的1～4、5～8、9～12分別對應魚粉蛋白胨、牛肉浸膏、安琪酵母粉質量濃度為20、28、36、40 g/L，h中的1～4、5～8、9～12分別對應牛肉浸膏、安琪酵母粉、玉米漿干粉質量濃度為20、28、36、40 g/L)；c、f、i-復合氮源濃度及配比的搖瓶發酵結果(泳道1～12與c圖中橫坐標一一對應)

2.5 重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ的3-L發酵

劉動斌等[19]曾將SulfolobussolfataricusP2來源的β-半乳糖苷酶在B.subtilisWS9中異源表達并進行了3-L罐的高密度發酵，最終酶活力可達76.5 U/mL，但酶的使用成本依舊過高。本研究在搖瓶水平對重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ的發酵培養基氮源進行了優化，成功將酶活力提高到了TB培養基的1.5倍，具有工業化應用的潛力，故進行3-L罐的放大培養。由于微生物發酵需要在一定的溫度下進行，過高過低均不利于微生物的生長及酶的表達，鑒于前人的經驗，選擇在3-L罐上采用33、37 ℃兩種溫度進行發酵，菌體的OD600值和酶活力隨時間的變化如圖5所示。由圖5-a可知，在這兩種發酵溫度下，菌體的OD600值變化基本一致，在發酵84 h左右均達到最高值，且均在120左右。但由圖5-b可知，37 ℃發酵下的最高酶活力遠遠高于33 ℃下發酵的酶活力，并且SDS-PAGE分析結果也顯示37℃發酵下的目的蛋白條帶要粗于33 ℃發酵下的目的蛋白條帶(圖5-c～圖5-f)。在37 ℃發酵下的最高酶活力可達138.29 U/mL(目的蛋白含量達8.87 mg/mL)，是搖瓶發酵酶活力(6.82 U/mL)的20.3倍，成功實現了從搖瓶到3-L的放大培養，具有很好的工業化應用前景。

1～14-發酵26、30、34、40、44、52、56、60、63、68、72、76、80、84 h樣品a-3-L罐33、37 ℃發酵菌體OD600值隨時間變化曲線；b-3-L罐33、37 ℃發酵總酶活力隨時間變化曲線；c-37 ℃發酵上清液；d-33 ℃發酵上清液；e-37 ℃破壁上清液；f-33 ℃破壁上清液

3 結論

本研究成功將B.circulans來源的β-半乳糖苷酶β-Gal-Ⅱ在B.SubtilisWS9中進行了異源表達，其最適pH及溫度分別為5.0和60 ℃，該酶在pH 5.0～7.0 具有很好的pH穩定性，在40 ℃下具有很好的熱穩定性，50 ℃下3 h左右降至初始酶活力的53.4%，60 ℃下30 min 該酶就幾乎完全喪失活性。在以40 g/L 乳糖為底物進行GOS制備時，50 ℃下的轉化率略高于40 ℃和60 ℃，反應8 h的GOS得率可達60.32%。由于其具有優秀的GOS制備能力，所以為了提高重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ的表達水平從而降低工業化生產的成本，首先在搖瓶進行了培養基氮源種類、濃度以及復合氮源的濃度及配比優化，最終在氮源為安琪酵母粉7.5 g/L+玉米漿干粉7.5 g/L時搖瓶表達水平最高，酶活力達6.82 U/mL，是TB培養基發酵的1.5倍，是單一氮源發酵的2～2.5倍。根據優化后的培養基進行了3-L罐的放大培養，并同時進行了33、37 ℃的發酵溫度優化，發現在這兩種發酵溫度下的菌體的生長濃度并無差別，但37 ℃發酵下的表達量遠遠高于33 ℃，最高酶活力可達138.29 U/mL，是搖瓶發酵的20.3倍，成功實現了從搖瓶到3-L的放大培養，為GOS的規?；苽涮峁┝嗣钢苿┌l酵的技術基礎。