miR-4701-5p通過下調CXCR4及其相關YAP信號通路對腎癌細胞增殖和遷移的影響

曾 光，胡曉暉，楊 超，杜 然

腎癌是一種起自腎小管上皮細胞的惡性腫瘤，是泌尿系統腫瘤相關死亡的主要原因之一[1]。誘發腎癌的因素眾多，如吸煙、肥胖、高血壓等，腎癌的發病率近年來逐年上升[2]。絕大多數腎癌患者對化療和放療都不敏感，手術是腎癌的主要治療方式[3]。積極探索新的分子靶向治療藥物是改善腎癌患者預后的重要手段。隨著非編碼RNA研究的進展，微小RNA(miRNA)被證實對各種腫瘤細胞的惡性生物學行為都能產生抑制作用[4]。其中，miR-4701-5p是一種新發現的miRNA，由miR-4701剪切生成[5]。研究表明，miR-4701-5p在肺腺癌組織和細胞株中低表達，恢復miR-4701-5p表達能夠抑制肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，改善肺腺癌細胞的順鉑耐藥性，發揮明顯的腫瘤抑制作用[6]。miR-4701-5p在腎癌中的表達及對腎癌惡性表型的影響報道較少。本研究旨在探討腎癌組織和細胞株中miR-4701-5p的表達水平，觀察恢復miR-4701-5p表達對腎癌細胞增殖和遷移的影響，并初步研究其機制，為臨床針對腎癌的靶向治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1細胞株及試劑 人腎癌細胞株OS-RC-2、A498、ACHN、SK-RC-20及正常腎小管上皮細胞株HK-2購自武漢典型培養物保藏中心。LipofectamineTM2000試劑和TRIzol試劑盒均購自美國Invitrogen公司。miR-4701-5p mimic、mimic NC購自北京索萊寶公司。胎牛血清和高糖培養基均購自美國Thermo Scientific HyClone公司。趨化因子受體4(CXCR4) mRNA野生型載體(psi-CHECK-2-CXCR4-WT)質粒、CXCR4 mRNA突變型載體(psi-CHECK-2-CXCR4-MUT)質粒購自美國Promega公司。辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。一抗YAP、CTGF、ANKRD1、β-Tubulin、CXCR4購自美國BD公司。

1.2細胞培養和分組處理 OS-RC-2、A498、ACHN、SK-RC-20細胞復蘇后在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養，HK-2細胞復蘇后在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，在37 ℃ 5% CO2條件下常規培養。傳代4～5次，取對數生長期SK-RC-20細胞培養于6孔板，將SK-RC-20細胞分為miR-4701-5p mimic組和mimic NC組，分別加入miR-4701-5p mimic、mimic NC，操作按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書執行，常規培養48 h后用于后續檢測。

1.3miR-4701-5p表達分析和靶基因預測 通過TCGA數據庫在線分析miR-4701-5p在腎癌組織和癌旁組織中的表達水平差異。應用生物信息學軟件miRGator對miR-4701-5p與CXCR4 mRNA的靶向關系進行預測。

1.4qPCR檢測細胞中miR-4701-5p和CXCR4 mRNA的表達 所有細胞均采用Trizol試劑提取總RNA，經超微量核酸檢測儀檢測RNA濃度和純度，通過逆轉錄試劑盒合成cDNA。建立qPCR循環體系，qPCR引物序列：GAPDH上游：CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，下游：GCGCCCAATACGACCAAATC；rRNA18S上游：ATTCCGATAACGAACGAGAC，下游：TCACAGACCTGTTATTGCTC；miR-4701-5p上游：ATGAGTTGGCCACCACACCTA，下游：TTGGCCACCACACCTACCCCTT；CXCR4上游：ACTACACCGAGGAAATGGGCT，下游：CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA。miR-4701-5p和CXCR4 mRNA表達水平采用2-ΔΔCt方法計算。

1.5雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-4701-5p與CXCR4的靶向關系 將SK-RC-20細胞分為CXCR4-WT組和CXCR4-MUT組，分別將miR-4701-5p mimic、mimic NC與構建的CXCR4-WT和CXCR4-MUT熒光質粒共轉染，每組4個復孔。孵育48 h后采用雙熒光素酶報告基因系統檢測各組SK-RC-20細胞螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性。

1.6集落形成實驗法檢測SK-RC-20細胞的增殖能力 采用胰酶消化各轉染組SK-RC-20細胞，以2 ml細胞懸液接種于6孔細胞培養板，每孔2×103個細胞，培養10 d后棄上清，采用2%多聚甲醛進行固定，采用結晶紫染液進行染色。流水充分清洗后，室溫下風干，計數統計每孔的集落形成數。

1.7Transwell實驗檢測SK-RC-20細胞的遷移能力 采用胰酶消化各轉染組SK-RC-20細胞，以500 μl細胞懸液接種于Transwell小室上室，加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培養基于下室。培養箱孵育24 h，采用2%多聚甲醛進行固定，采用Giemsa染液進行染色，采用棉簽擦掉未穿過底膜的細胞。在40倍光學顯微鏡下選擇6個視野拍照并統計遷移細胞數。

1.8Western blotting檢測SK-RC-20細胞中CXCR4蛋白和YAP信號通路蛋白的表達 采用胰酶消化各轉染組SK-RC-20細胞，采用PBS清洗5次，用RIPA裂解液裂解并提取細胞總蛋白，分別取60 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳以及硝酸纖維素膜轉膜。于10%脫脂牛奶中封閉150 min，分別孵育一抗YAP、CTGF、ANKRD1、β-Tubulin、CXCR4(濃度均為1∶1000)，加入1∶4000的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗，均勻孵育，化學發光顯色液，在暗室中曝光、顯影，β-Tubulin為內參蛋白。

2 結果

2.1miR-4701-5p在腎癌組織和腎癌細胞株中的表達 TCGA數據庫顯示，腎癌組織中miR-4701-5p的表達水平低于癌旁組織(P<0.01)，見圖1。qPCR檢測結果顯示，miR-4701-5p在腎癌OS-RC-2、A498、ACHN、SK-RC-20細胞株中的表達水平低于HK-2細胞，SK-RC-20細胞株中miR-4701-5p表達低于OS-RC-2、A498、ACHN細胞(P<0.05，P<0.01)，見圖2。故選擇SK-RC-20細胞進行后續實驗。

圖1 miR-4701-5p在腎癌組織及癌旁組織中的表達情況

圖2 miR-4701-5p在腎癌細胞株中的表達情況

2.2miR-4701-5p過表達效率 轉染后，mimic NC組和miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞中miR-4701-5p表達水平分別為1.03±0.47和11.02±1.72。miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞中miR-4701-5p表達率高于mimic NC組(P<0.01)。

2.3miR-4701-5p過表達可抑制SK-RC-20細胞的增殖 集落形成實驗結果顯示，miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞集落形成數少于mimic NC組(P<0.01)。見圖3。

圖3 miR-4701-5p過表達對SK-RC-20細胞增殖的影響

2.4miR-4701-5p過表達可抑制SK-RC-20細胞的遷移 Transwell實驗結果顯示，miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞遷移細胞數少于mimic NC組(P<0.05)，見圖4。

2.5miR-4701-5p靶向結合CXCR4 mRNA 通過生物信息學軟件miRGator預測顯示，CXCR4 mRNA序列上存在與miR-4701-5p互補結合的位點，見圖5。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，共轉染CXCR4 mRNA野生型載體/miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞株中相對熒光素酶活性低于mimic NC組(P<0.01);共轉染CXCR4 mRNA突變型載體/miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞株中相對熒光素酶活性與mimic NC組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6。

圖5 miR-4701-5p與CXCR4 mRNA的靶向關系CXCR4為趨化因子受體4

圖6 SK-RC-20細胞株中miR-4701-5p相對熒光素酶活性

2.6miR-4701-5p靶向抑制CXCR4 mRNA表達 mimic NC組和miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞株中CXCR4 mRNA表達水平分別為6.91±1.48和1.05±0.46。miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞株中CXCR4 mRNA表達量低于mimic NC組(P<0.01)。

2.7CXCR4蛋白和YAP信號通路蛋白表達 與mimic NC組相比，miR-4701-5p mimic組SK-RC-20細胞中CXCR4蛋白及YAP信號通路蛋白YAP、CTGF、ANKRD1表達水平均明顯降低。見圖7。

圖7 miR-4701-5p對SK-RC-20細胞中CXCR4蛋白及YAP信號通路蛋白表達的影響

3 討論

近年來研究顯示，miRNA在疾病的發生和發展過程中發揮重要調控作用，已成為各種疾病治療研究的熱點[7-9]。miRNA在腎癌診斷、治療和預后監測方面可能具有應用潛力[10-11]。HUANG等[12]發現，miR-140-5p在腎癌組織中表達上調，其在體外能夠促進腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲，敲除miR-140-5p可顯著抑制腎癌裸鼠模型的腫瘤生長和肺轉移。ZENG等[13]發現，miR-92a-3p在腎癌組織和細胞株中表達顯著上調，miR-92a-3p過表達促進腎癌細胞增殖和集落形成，下調miR-92a-3p則抑制腎癌細胞增殖和集落形成。miR-4701-5p在多種疾病中起關鍵作用[6]。BI等[5]研究發現，miR-4701-5p能夠顯著抑制類風濕性關節炎成纖維細胞樣滑膜細胞增殖、遷移和侵襲。LI等[14]研究發現，miR-4701-5p在體外可降低慢性粒細胞白血病細胞對多種化療藥物的耐藥性，并且在小鼠體內將腫瘤細胞從阿霉素耐藥轉化為易感細胞。本研究結果顯示，在腎癌組織和細胞株中miR-4701-5p表達水平分別低于癌旁組織和正常腎小管上皮細胞，提示miR-4701-5p可能發揮抑制腎癌進展的作用。

本研究體外實驗顯示，miR-4701-5p過表達能夠顯著降低SK-RC-20細胞的增殖水平和遷移能力。研究表明，miRNA通過靶向結合靶基因mRNA，下調靶基因的表達，影響腫瘤細胞的惡性表型[15]。本研究通過生物信息學軟件miRGator預測顯示，CXCR4 mRNA序列上存在與miR-4701-5p互補結合的位點。CXCR4蛋白屬于具有化學趨化作用的細胞因子超家族成員，其基因定位在染色體2q21，大小為352個氨基酸[16]。CXCR4參與介導腫瘤發生、免疫反應、血管生成等各種病理和生理進程[17]。CXCR4在胃癌、乳腺癌、骨肉瘤等腫瘤中高表達，誘導腫瘤細胞的增殖和轉移，與患者的預后呈負相關[18]。CXCR4在腎癌組織和細胞株中高表達，能夠顯著增強腎癌786-O和769-P細胞的增殖和遷移[19]。本研究結果顯示，miR-4701-5p可以靶向結合并抑制CXCR4基因的表達，CXCR4是miR-4701-5p的靶基因。已有研究證實，CXCR4蛋白通過激活YAP信號通路，誘導腫瘤的進展[20]。本研究結果顯示，miR-4701-5p過表達顯著抑制YAP信號通路的激活，進一步證實miR-4701-5p通過調節CXCR4基因表達發揮作用。

綜上所述，miR-4701-5p在腎癌組織和細胞株中表達降低，miR-4701-5p過表達可以靶向抑制CXCR4基因表達，進而抑制YAP信號通路的激活，減弱腎癌SK-RC-20細胞增殖和遷移。miR-4701-5p可能成為腎癌基因治療研究的新靶點。