氫氣通過Bax/Caspase3凋亡通路減輕大鼠創傷性腦損傷的研究

錢 波，馮 瑩，鄒卓群

創傷性腦損傷為神經外科常見疾病之一，致傷因素主要包括暴力事件、交通事故[1]。該病具有高致殘率和高致死率，可導致運動障礙、神經功能障礙，嚴重者可喪失生活自理能力，影響其生存質量[2]。創傷性腦損傷一旦發生便不可逆，現臨床尚缺乏有效治療方法[3]。氫能透過亞細胞結構，清除氧自由基，減輕氧化應激損傷，抑制神經細胞凋亡，改善學習記憶能力，減輕炎癥損傷[4]。已有研究報道，氫氣在創傷性腦損傷中具有保護作用[5]，而關于氫氣在創傷性腦損傷中發揮效應的機制研究尚少。B淋巴細胞瘤/白血病-2相關X蛋白(Bax)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)通路是一種與凋亡關系密切的重要通路，能夠參與創傷性腦損傷的病情進展[6]。研究顯示，氫水注射降低了損傷后脊髓中Caspase3活性[7]。有學者發現，氫水能夠下調蛛網膜下腔出血(SAH)后早期腦損傷大鼠腦組織中Bax、Caspase3表達水平，減輕其神經細胞凋亡[8]?；诖耍狙芯刻接憵錃馐欠裢ㄟ^Bax/Caspase3凋亡通路減輕大鼠創傷性腦損傷。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性SD大鼠56只，36～40月齡，280～320 g，SPF級，購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)2017-0012。本實驗經我院實驗動物管理倫理委員會批準(IACUC-2021-047)，實驗動物的使用和處理遵循3R原則。

1.2實驗方法

1.2.1模型制作及分組處理：將56只大鼠隨機分為對照組、模型組、氫氣+通路激活組、氫氣組，每組14只。模型制作方法：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，麻醉后以俯臥位固定于手術臺上，沿大鼠顱骨正中線作一縱切口，暴露右側頂骨，于矢狀縫旁開2 mm位置應用顱骨鉆制作一個孔(直徑約為5 mm)，使用小錘(致傷力度為20 g)自大鼠上方50 cm高度自由落下，制備創傷性腦損傷大鼠模型，止血并縫合，在此過程中保持其硬腦膜完整[9]。造模成功標準：術后可見大鼠不同程度肢體抽搐，呼吸不規則，四肢平衡協調能力變差，瞳孔異常縮小或者擴大、對光反射明顯減弱，睫毛反射及刺痛反應消失，部分大鼠可見口腔或鼻腔出血甚至暫時性昏迷，但各行為異?？稍?0 min內恢復。對照組大鼠除不進行撞擊操作外，其余操作相同。造模結束后，氫氣組每天吸入1 h氫氣(42% H2-21% O2-37% N2)，共干預7 d；氫氣+通路激活組在氫氣組基礎上應用Bax/Caspase3激活劑干預，將5 μg激活劑加入5 μl人工腦脊液中，通過滲壓性微量注射泵(蘇州訊飛科學儀器有限公司)腦內注射，在10 min內完成注射，共注射1次[10]。對照組和模型組大鼠以相同方式予等劑量生理鹽水。

1.2.2標本制作:7 d后于尾尖采血3 ml，3000 r/min離心15 min，獲取血清標本，于冰箱中保存待測。大鼠采血后斷頭取腦，將腦組織在5%多聚甲醛中固定48 h，取挫傷腦組織(挫傷灶為中心，半徑為2 cm，厚度為2 mm)分為2份，脫水，以液氮封存于冰箱中待測，一份用于腦含水率測定，另一份用于其他指標檢測。

1.2.3HE染色觀察腦組織病理形態:從冰箱中取出相應腦組織標本，制成5 μm厚切片，用HE染色試劑盒染色，脫水，透明，封片，在XSP-2CA光學顯微鏡下觀察脊髓背角病理變化。

1.2.4ELISA檢測炎性和氧化應激指標水平：取相應試劑盒在酶標儀上應用ELISA檢測白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平。

1.2.5神經功能損傷嚴重程度評分(NSS)和腦含水率：NSS包括運動能力實驗、反射實驗、協調性實驗、警覺性實驗，最高分為18分，評分越高提示顱腦損傷越重[11]。干濕比重法檢測大鼠腦含水率，從冰箱中取出相應腦組織標本，去除凝血，洗去血跡，濾紙吸干表面水分，應用電子天平(東莞市譜標實驗器材科技有限公司)測量其濕重，于烘烤箱烘烤96 h后測量其干重，含水率=(濕重-干重)/濕重×100%[12]。

1.2.6Western blot法檢測Bax/Caspase3通路蛋白表達：從冰箱中取出相應腦組織標本，加入蛋白裂解液(預冷)，勻漿機制成勻漿液，然后以3000 r/min，4 ℃條件下離心20 min，取上清液(總蛋白)，將其轉移至Ep管中，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，行SDS-PAGE電泳，用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜上，浸泡在5%脫脂奶粉內封閉2 h(25 ℃)，加入相應一抗，即兔抗Bax單克隆抗體(1∶500)、兔抗Caspase3單克隆抗體(1∶300)、兔抗β-actin單克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜，經TBST漂洗3次后加入HRP標記的羊抗兔二抗(1∶2000)，室溫孵育2 h，經TBST漂洗3次后用免疫印跡化學發光試劑(ECLReagent)顯色，通過凝膠成像系統對圖像進行拍攝，并使用Tanon軟件對各組蛋白表達量進行分析。

2 結果

2.1氫氣對創傷性腦損傷大鼠NSS和腦含水率的影響 實驗過程中模型組死亡3只，氫氣+通路激活組和氫氣組各死亡1只，對照組無大鼠死亡。模型組NSS和腦含水率高于對照組(P<0.05)；氫氣+通路激活組和氫氣組NSS和腦含水率低于模型組，且氫氣組低于氫氣+通路激活組(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠NSS和腦含水率比較

2.2氫氣對創傷性腦損傷大鼠腦組織病理的影響 對照組腦組織結構正常且清晰，細胞排列整齊，呈規則形狀，未見出血、腫脹及炎性浸潤等。模型組腦組織水腫嚴重，細胞間隙明顯增大，細胞核明顯固縮，變性壞死、出血壞死及炎性浸潤十分明顯。氫氣組腦組織病理變化較模型組明顯減輕，病灶區和水腫區縮小，變性壞死、出血壞死及炎性浸潤減少。氫氣+通路激活組對腦組織病理的改善作用較氫氣組有所減弱。見圖1。

圖1 4組大鼠腦組織病理變化(HE×400，箭頭為病灶區)1a.對照組；1b.模型組；1c.氫氣+通路激活組；1d.氫氣組；模型組為創傷性腦損傷大鼠

2.3氫氣對創傷性腦損傷大鼠炎性指標的影響 模型組TNF-α和IL-1β水平高于對照組(P<0.05)；氫氣+通路激活組和氫氣組TNF-α和IL-1β水平低于模型組，且氫氣組低于氫氣+通路激活組(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平變化

2.4氫氣對創傷性腦損傷大鼠氧化應激的影響 模型組SOD水平低于對照組,MDA水平高于對照組(P<0.05)。氫氣+通路激活組和氫氣組SOD水平高于模型組,MDA水平低于模型組(P<0.05)；氫氣組SOD水平高于氫氣+通路激活組，MDA水平低于氫氣+通路激活組(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠血清SOD和MDA水平比較

2.5氫氣對創傷性腦損傷大鼠Bax/Caspase3凋亡通路的影響 模型組腦組織Bax和Caspase3蛋白表達量高于對照組(P<0.05)。氫氣+通路激活組和氫氣組腦組織Bax和Caspase3蛋白表達量低于模型組，且氫氣組低于氫氣+通路激活組(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 4組大鼠腦組織Bax/Caspase3凋亡通路相關蛋白表達量比較

圖2 4組大鼠腦組織Bax和Caspase3蛋白表達情況

3 討論

由于目前創傷性腦損傷治療技術和方法受限，其治療效果不太理想，致殘率和病死率居高不下。氫氣近年來逐漸應用于多種臨床研究中[13]。氫氣具有極強的擴散性，極易穿過細胞膜。研究顯示，高壓氫氣對皮膚鱗狀細胞癌有一定治療效果[14]。另有學者發現，吸入2%氫氣能夠有效清除自由基，減輕大腦缺血再灌注損傷[15]。有研究報道，氫氣具有抗氧化作用，氫水能顯著降低血腦屏障的通透性，明顯減輕腦水腫，顯著縮小腦損傷病灶面積，提高因外傷性腦損傷引發的神經功能障礙，且這些正向效應與腦組織中8異前列腺素F2a(8-iso-PGF2a)、MDA水平下調和SOD、過氧化氫酶(CAT)水平上調有關[16]。本研究發現，氫氣能夠減輕創傷性腦損傷大鼠腦組織病理損傷，即氫氣組腦組織病理變化較模型組明顯減輕，病灶區和水腫區縮小，變性壞死、出血壞死及炎性細胞浸潤減少，且氫氣組NSS、腦含水率較模型組顯著降低，提示氫氣對大鼠創傷性腦損傷具有一定改善作用。創傷性腦損傷后腦組織內大量炎性細胞浸潤，炎性因子大量釋放，引起鄰近組織的炎癥反應，誘發創傷性腦損傷后繼發性腦損傷。此外，創傷性腦損傷后因紅細胞破裂，自由基釋放增多，創傷區出現水腫及細胞凋亡反應，觸發機體氧化應激損傷，引起MDA和SOD水平異常變化。本研究中，氫氣組TNF-α、IL-1β、MDA水平較模型組顯著降低，SOD水平較模型組顯著增高，提示氫氣能夠降低創傷性腦損傷大鼠炎癥和氧化應激水平。

細胞凋亡主要通過細胞內線粒體途徑和細胞外死亡受體途徑實現，2條途徑最終均是通過活化凋亡相關蛋白酶Caspase而發揮凋亡效應。Bax為Bcl-2家族中十分重要的促凋亡蛋白分子之一，由6個外顯子編碼，可在線粒體外膜處形成通道蛋白，促使細胞色素C(Cyt C)進入胞漿內，活化下游的凋亡蛋白Caspase。Caspase3為Caspase家族中的凋亡效應因子之一，可直接誘導細胞凋亡，亦可通過調節其他凋亡因子而誘導細胞凋亡。Bax和Caspase3之間能夠相互影響，共同參與并調控細胞凋亡進程[17]。研究顯示，頭顱打擊傷后1 h，病灶皮層下海馬區Bax mRNA表達量、Caspase3陽性染色細胞數明顯升高，24～48 h達高峰，隨后逐漸下調，恢復至正常[18]。有學者發現，Caspase3在創傷性腦損傷后神經細胞凋亡中具有關鍵性作用[19]。本研究結果提示，Bax、Caspase3蛋白在大鼠創傷性腦損傷后呈高表達趨勢。本研究結果發現，氫氣+Bax/Caspase3組腦組織Bax、Caspase3蛋白表達量較氫氣組明顯上調，減弱了氫氣對創傷性腦損傷大鼠炎癥、氧化應激、腦組織病理損傷的改善作用，提示氫氣可能通過抗Bax/Caspase3凋亡通路對大鼠創傷性腦損傷起到改善作用。

綜上所述，氫氣對大鼠創傷性腦損傷具有一定改善作用，能夠減輕炎癥反應,降低氧化應激水平，減輕腦組織病理損傷，其機制可能與氫氣抗Bax/Caspase3凋亡通路有關，但是否還有其他機制有待進一步研究。