非小細胞肺癌血漿EGFR基因突變豐度對吉非替尼治療效果的影響

張馨文，王 波，許 果

肺癌是常見惡性腫瘤之一，在我國惡性腫瘤中致死率居第一位，其中80%為非小細胞肺癌，臨床約75%患者發現時已經處于中晚期，錯過最佳手術治療時機，5年生存率很低。臨床對中晚期患者通常應用放化療治療[1-3]。表皮生長因子受體(EGFR)基因是重要的腫瘤驅動基因，其編碼的EGFR蛋白可啟動PI3K/AKT等多條信號通路，在惡性腫瘤細胞增殖、侵襲、血管生成等惡性生物學進程中發揮重要作用[4-6]。目前臨床常用靶向藥物——吉非替尼治療EGFR敏感型非小細胞肺癌。吉非替尼是針對EGFR靶點的小分子酪氨酸激酶抑制劑[7]。但在治療中，EGFR敏感型患者對吉非替尼臨床療效存在顯著個體化差異。研究顯示，EGFR基因突變豐度與EGFR酪氨酸抑制劑藥物的療效密切相關，但受限于組織取材大小條件無法進行大樣本研究。本研究主要研究血漿EGFR基因突變豐度與非小細胞肺癌患者吉非替尼療效的相關性，探討血漿EGFR基因突變豐度預測吉非替尼對EGFR敏感型非小細胞肺癌療效的可行性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年1月—2019年6月本院收治的經病理檢查證實的非小細胞肺癌患者，取手術切除癌組織標本及血漿標本進行分析。納入標準：年齡≥18歲；有可測的局部病灶或轉移病灶；腫瘤組織可滿足基因分析條件；預計生存期≥3個月。排除標準：合并其他惡性腫瘤；EGFR敏感型非小細胞肺癌患者對吉非替尼治療方案不耐受。共收集符合納入及排除標準的非小細胞肺癌135例，其中男83例，女52例；年齡18～53(31.24±4.37)歲；臨床分期：ⅢB期71例，Ⅳ期64例；病理類型：腺癌85例，鱗癌47例，腺鱗癌3例；有吸煙史76例，無吸煙史59例。患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1基因突變檢測：通過組織DNA提取試劑盒(美國OMEGA公司)提取組織基因組DNA，嚴格參照試劑盒說明書進行操作。采用PCR擴增，加入PNA 2 μl，引物序列為CTACGCCACCAGCTC，反應體系為10×PCR緩沖液10 μl，2.5 mmol/L的dNTP 8 μl，正反向引物各0.5 μl，Taq酶5 μl， 100 μmol/L的PNA 2 μl，模板DNA 6 μl，添加去離子水至100 μl。PCR反應程序為,95 ℃預熱3 min，95 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，后3個步驟重復35次。若突變含量>20%，判定為高豐度突變;突變含量≤20%，判定為低豐度突變。

1.2.2EGFR敏感型非小細胞肺癌患者治療方案：吉非替尼(AstraZeneca UK Limited，批號20140142)250 mg，固定時間服用，1/d，持續服用至疾病進展或出現毒副作用。吉非替尼治療期間不進行其他抗腫瘤治療。

1.2.3療效評價標準：EGFR敏感型非小細胞肺癌患者(EGFR突變者)規范服用吉非替尼治療后行腹部B超、胸部CT、頭顱MRI檢查，對目標病灶及轉移病灶進行評價，以入組時基線檢查結果為參照，按照文獻[8]中實體瘤療效判定標準進行評估,完全緩解(CR)+部分緩解(PR)為療效好，疾病穩定(SD)+疾病進展(PD)為療效差。

1.2.4隨訪:入組患者采用電話或門診檢查等方式進行隨訪，每8周1次。主要觀察指標：總生存時間(OS)為從吉非替尼治療開始至任何原因引起死亡的時間。無進展生存時間(PFS)為從吉非替尼治療開始至腫瘤進展或任何原因引起死亡的時間。所有患者隨訪3.5～36.9個月，中位隨訪時間為21.7個月，隨訪率為100.0%。以隨訪期間患者發生腫瘤進展以及死亡為預后不良，腫瘤無進展為預后良好。

1.3統計學方法 采用統計學軟件包SPSS 20.0進行分析。計數資料以率(%)表示，采用χ2檢驗；EGFR基因檢測結果比較采用一致性檢測；生存分析采用Kaplan-Meier法，兩兩比較采用Log-Rank檢驗，使用Bonferroni法進行檢驗水準的校正；影響因素分析采用Cox比例風險模型，采用輸入法為變量篩選方法。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1腫瘤組織與血漿EGFR基因突變一致性檢測 135例腫瘤組織中EGFR基因突變率為34.8%(47/135)，血漿中EGFR基因突變率為29.6%(40/135)。二者檢測結果高度一致(Kappa=0.813，P<0.01)。見表1。

2.2EGFR敏感型非小細胞肺癌患者吉非替尼臨床療效與臨床病理特征關系 40例EGFR敏感型非小細胞肺癌患者吉非替尼治療后CR 9例，PR 16例，SD 8例，PD 7例，即療效好25例，療效差15例。EGFR敏感型非小細胞肺癌患者吉非替尼療效與患者性別、年齡、吸煙與否、TNM分期、病理類型、分化程度無關(P>0.05)。見表2。

表2 EGFR敏感型非小細胞肺癌患者吉非替尼臨床療效與臨床病理特征關系(例)

2.3血漿EGFR基因突變豐度與EGFR敏感型非小細胞肺癌患者臨床療效相關性 根據患者血漿EGFR基因是否突變及突變豐度，將40例EGFR敏感型非小細胞肺癌患者分為低豐度組22例、高豐度組18例。基因突變高豐度組療效好15例，療效差3例；基因突變低豐度組療效好10例，療效差12例。基因突變高豐度組療效優于基因突變低豐度組(P<0.01)。

2.4血漿EGFR基因突變豐度對EGFR敏感型非小細胞肺癌患者臨床預后的影響 EGFR基因突變低豐度組、高豐度組OS分別為14(13.1～14.8)個月、17(15.6～18.4)個月；EGFR基因突變高豐度組OS長于低豐度組(P<0.05)。見圖1。EGFR基因突變低豐度組、高豐度組PFS分別為12(9.3～14.6)個月、15(12.9～17.1)個月；2組PFS比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 不同血漿EGFR基因突變豐度EGFR敏感型非小細胞肺癌患者OS的Kaplan-Meier曲線

圖2 不同血漿EGFR基因突變豐度EGFR敏感型非小細胞肺癌患者PFS的Kaplan-Meier曲線

2.5影響EGFR敏感型非小細胞肺癌患者吉非替尼治療預后的因素 以EGFR敏感型非小細胞肺癌患者治療后預后不良為因變量，EGFR基因突變低豐度、EGFR基因突變高豐度作為自變量，Cox分析顯示，EGFR基因突變高豐度是吉非替尼治療后預后不良的保護因素(P<0.01)。見表3。

表3 非小細胞肺癌吉非替尼治療預后的影響因素Cox回歸分析

3 討論

EGFR是上皮生長因子細胞增殖和信號傳導的受體，可與配體結合產生受體的二聚體，激活下游信號通路，通過PI3K/AKT等通路促進腫瘤細胞的增殖與遷移[9]。靶向EGFR的單克隆抗體可阻礙EGFR與其配體結合，阻斷下游信號通路激活，進而抑制腫瘤細胞增殖、轉移及血管生成[10]。

EGFR激酶區突變已成為公認的有效預測吉非替尼療效的生物學指標[11]，但臨床研究發現，即使同為攜帶EGFR突變的肺癌患者對吉非替尼療效也存在差異性[12]，推測EGFR突變豐度可能與吉非替尼對晚期肺癌的療效有關。此前研究多采用病理組織穿刺、活檢等手段獲取，為有創性檢查，且穿刺獲取組織量少，也無法排除正常組織對結果的影響，MATSUMOTO等[13]研究表明，非小細胞肺癌組織腫瘤細胞比例>80%時才可得到可靠結果。李文清等[14]研究顯示，腫瘤患者血漿k-ras DNA突變水平高，提示檢測血漿DNA突變具有可行性。本研究結果顯示，非小細胞肺癌患者血漿EGFR突變率為29.6%，主要集中在外顯子21。有研究顯示，亞洲患者EGFR突變率高于歐洲白種人，同時吉非替尼對亞洲非小細胞肺癌患者療效高于歐洲白種人，提示EGFR突變與吉非替尼療效有關[15]。本研究結果顯示，血漿EGFR基因突變狀態與腫瘤組織檢測一致性較高，提示血漿EGFR基因狀態檢測可以部分代替患者腫瘤組織檢測以指導藥物靶向治療。

本研究結果顯示，EGFR基因突變高豐度組療效優于低豐度組，高豐度組OS長于低豐度組，提示非小細胞肺癌患者EGFR基因突變豐度的高低以及是否發生突變與吉非替尼的療效有關，但EGFR基因突變高豐度組與低豐度組PFS比較差異無統計學意義，可能原因為本研究病例數較少。進一步Cox回歸分析顯示，EGFR基因突變高豐度可降低非小細胞肺癌吉非替尼治療預后不良的發生率，提示血漿EGFR基因突變豐度檢測可能可作為非小細胞肺癌臨床療效及預后的預測指標，避免EGFR基因突變低豐度患者盲目用藥，為臨床個性化治療提供參考。

綜上所述，血漿EGFR基因突變豐度檢測與EGFR敏感型非小細胞肺癌患者吉非替尼臨床療效相關，檢測EGFR基因突變豐度可較好預測吉非替尼治療EGFR敏感型非小細胞肺癌臨床效果，可作為預測吉非替尼獲益的有效手段。