益生菌輔助治療兒童難治性癲癇的臨床效果及對腸道微生態、炎性因子的影響

張金來，曹月榮，于 潔，張 倩，尹雪艷

癲癇是一種因腦神經元迸發性異常放電，導致大腦出現一過性功能紊亂的慢性疾病[1]。據調研統計，我國癲癇患病率高達0.7%，且兒童為主要發病人群[2]，有65%～75%癲癇患兒經過系統性的抗癲癇藥物治療，可獲得良好的臨床療效。然而，仍有30%～40%的癲癇患兒不能得到很好的控制，這些病例被認為患有兒童難治性癲癇(CRE)[3-4]。癲癇具有短暫性及反復性2個基本特征，可一定程度的影響患兒腦部發育，嚴重者可導致神經系統受損，嚴重影響患兒健康成長[5]。多項研究表明，免疫功能紊亂及炎性介質釋放均可促進CRE的發生及發展，因此有效調節患兒免疫功能，減輕機體炎癥反應對治療本病具有積極的臨床意義[6-7]。近年發現益生菌也是抗癲癇的治療靶點之一。腸道菌群由致病菌、機會致病菌及益生菌組成，有研究發現，益生菌所產生的短鏈脂肪酸和乳酸代謝終末產物具有治療及預防腸道內和腸道外來源疾病的作用，同時還具有抑制炎性因子釋放及調節免疫系統的作用[8-9]。故此本研究將益生菌用于CRE的輔助治療，觀察其臨床療效及對腸道微生態、炎性因子、免疫因子的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年6月—2019年9月滄州市中心醫院收治的62例CRE進行隨訪研究，其中男32例(51.61%)，女30例(48.39%)；年齡7個月～8歲(5.63±0.59)歲；每月癲癇發作頻次6～15(10.18±1.46)次。疾病分類：Dravet綜合征7例(11.29%)，Lennox-Gastaut綜合征3例(4.84%)，嬰兒痙攣癥22例(35.48%)，結節性硬化癥6例(9.68%)，全面性癲癇12例(19.35%)，部分局灶性癲癇7例(11.29%)，Ⅰ型葡萄糖轉運蛋白缺陷癥5例(8.06%)。①納入標準：均符合中華醫學會制定的《臨床診療指南：癲癇病分冊》[10]中CRE相關診斷標準；應用≥3種抗癲癇藥物治療后，每月癲癇發作頻率仍≥4次；年齡≤12歲；90 d內未使用過其他影響腸道菌群的藥物；患兒監護人同意應用益生菌輔助治療，并簽署知情同意書。②排除標準：合并心、肝、腎等重要臟器功能異常者；合并感染或傳染性疾病者；合并全身炎癥性疾病或免疫功能缺陷者；合并嚴重精神疾病或認知功能障礙者；有益生菌治療相對或絕對禁忌證者；治療依從性較差者。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準同意。

1.2研究方法 所有患兒在常規治療基礎上聯合益生菌輔助治療，常規治療：左乙拉西坦[優時比(珠海)制藥有限公司，國藥準字J20160085]口服，起始劑量為10 mg/(kg·d)，2/d，此后每周根據病情在原治療基礎上劑量增加10 mg/(kg·d)，劑量調整期為3～7周，如劑量調整期患兒癲癇得到有效控制，則按原有劑量維持治療。如癲癇控制不佳，則按規律調整劑量，劑量最高達到60 mg/(kg·d)后維持治療。益生菌輔助治療：雙歧桿菌三聯活菌散(上海上藥信誼藥廠有限公司，國藥準字S10970104)1 g口服，2/d。均連續治療12周。

1.3觀察指標

1.3.1臨床療效：依據Engel分級[11]評估患兒治療4、8、12周后癲癇控制情況，Ⅰ級(顯效)：患兒治療后癲癇無發作；Ⅱ級(有效)：患兒治療后較治療前癲癇發作減少90%～99%；Ⅲ級(緩解)：患兒治療后較治療前癲癇發作減少50%～89%；Ⅳ級(無效)：患兒治療后較治療前癲癇發作減少<50%或增加?？傆行?(Ⅰ級+Ⅱ級+Ⅲ級)/總例數×100%。

1.3.2腸道菌群：無菌狀態下采集新鮮糞便3 g，置于無菌離心管，-20 ℃環境保存。細菌培養采用日本光岡知足法，選擇酵母菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌及選擇性培養基。細菌鑒定至菌屬水平采用細菌三級鑒定法，下限設定為2×102CFU/g濕便。取對數lgN(CFU/g)記錄菌落水平變化。另外無菌采集新鮮糞便約2 g放入無菌離心管-20 ℃環境保存。用DNA提取試劑盒QlAamp Baceria DNAKit提取標準菌株DNA測定其濃度并計算標準品PCR片段銬貝數。將糞便離心洗滌，采用相同方法提取細菌總DNA。應用自行設計的引物對糞便細菌DNA進行熒光定量PCR(試劑盒購自AB公司)，反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，共4個循環。據反應后擴增曲線計算細菌拷貝數，結果以lg CFU/g濕便表示。

1.3.3炎性因子及免疫因子：治療前后抽取晨起空腹肘靜脈血5 ml，置抗凝管中，離心12 min，取上清液，-80 ℃環境保存。使用Adlitteram Diagnostic Laboratories公司生產的anthos 2010型酶標儀，應用酶聯免疫吸附試驗檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-17A水平；應用免疫比濁法檢測血清免疫球蛋白IgA、IgM、IgG水平。

2 結果

2.1臨床療效比較 62例CRE經益生菌輔助治療4、8、12周后，總有效率分別為38.71%、66.13%、85.48%，整體總有效率隨治療時間延長呈逐漸上升趨勢，不同時間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 益生菌輔助治療不同時間62例兒童難治性癲癇臨床療效比較[例(%)]

2.2治療前后腸道菌群菌落數變化 62例CRE經益生菌輔助治療12周后，患兒腸道大腸桿菌及糞腸球菌菌落數較治療前顯著降低，雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落數較治療前顯著升高(P<0.05)。見表2。2.3治療前后免疫球蛋白水平變化 62例CRE經益生菌輔助治療12周后，患兒IgA、IgG、IgM水平較治療前顯著升高(P<0.05)。見表3。

表2 益生菌輔助治療前后62例兒童難治性癲癇治療前后腸道菌群菌落數比較

表3 益生菌輔助治療前后62例兒童難治性癲癇治療前后免疫球蛋白水平比較

2.4治療前后炎性因子水平 62例CRE經益生菌輔助治療12周后，患兒TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A較治療前顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 益生菌輔助治療前后62例兒童難治性癲癇治療前后炎性因子水平比較

3 討論

由于CRE發病機制極其復雜，因此對CRE進行有效治療仍是兒科疾病中的難題之一。目前，在臨床上對CRE的治療方案仍在不斷探索中，新型抗癲癇藥物的應用及多藥聯合治療CRE具有較好的臨床效果，但仍有35%患兒得不到有效的控制，因此其他癲癇輔助治療方案受到廣泛關注[12]。

腸道與中樞神經系統有著復雜的雙向交流機制，即在健康和疾病背景下相互影響的腦-腸軸，其中腸道菌群紊亂可影響神經功能，反之亦然[13]。越來越多的學者認為，腸道菌群可參與癲癇的發生及發展。CHEN等[14]研究指出，腦-腸軸異?？蓪е履c易激綜合征的發生，而腸易激綜合征可使癲癇的發病風險增加。董楝和馮占輝[15]研究指出，癲癇患者存在腸道菌群失調的現象，進而通過代謝物質、神經遞質、炎性因子、免疫因子等多種途徑引起癲癇的發生及發展。故調節腸道菌群可作為治療癲癇的新靶點。

益生菌藥物是一種不可消化的食物纖維，含有長型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌等，可通過選擇性地增加腸道優勢菌群的生長及活性，保障機體的健康。相關研究表明，益生菌治療可逆轉腸道菌群的失調，減少致病菌及其代謝產物的黏膜轉移，增加抗體產生，增強上皮表面的完整性；且可通過促進黏蛋白分泌，增強腸黏膜屏障功能，阻止腸道病原微生物生長，調節機體免疫平衡[16-17]。本研究結果顯示，62例CRE經益生菌輔助治療4、8、12周后，總有效率分別為38.71%、66.13%、85.48%，整體總有效率隨治療時間延長呈逐漸上升趨勢；且經益生菌輔助治療12周后，患兒大腸桿菌及糞腸球菌菌落數較治療前顯著降低，雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落數較治療前顯著升高。分析原因可能為益生菌輔助治療可減少腸道有害菌群，增加益生菌群，調節腦-腸軸，改善其負面影響，控制癲癇的發作，本文研究結果與GOMEZ-EGUILAZ等[18]研究結果一致。

相關研究顯示，免疫功能障礙先于癲癇發作發生，并能引起癲癇發作，同時癲癇發作可導致免疫功能紊亂及血腦屏障功能障礙[19-21]。免疫功能紊亂可誘導白細胞活化及細胞因子的分泌，而上述細胞因子可通過受損的血腦屏障，誘發炎性因子的釋放，進一步導致內流鉀離子通道的減少及對于鉀離子緩沖能力的降低，促使神經元興奮性上升，導致癲癇發作閾值降低，引起癲癇發作，形成惡性循環。因此有效調控機體免疫功能，降低炎性因子的釋放對改善CRE病情具有積極意義。本研究結果還顯示，62例CRE經益生菌輔助治療12周后，患兒IgA、IgG、IgM水平較治療前顯著升高，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A水平較治療前顯著降低。分析原因可能為益生菌輔助治療可刺激分泌性免疫球蛋白的生成，調節機體免疫功能，阻止炎性因子的釋放，提高臨床療效。

綜上所述，益生菌輔助治療CRE具有良好的臨床效果，可顯著降低炎性因子水平，調節機體免疫功能，促進CRE病情控制。但本研究納入病例數較少，研究周期較短，且未對益生菌治療的安全性進行分析，研究結果易出現偏移，需要更長期的臨床隨訪及隨機對照試驗來研究，以期為CRE提供更為安全有效的治療方案。